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Precellys Evolution—蛋白質樣本制備理想方案

閱讀：1585 發(fā)布時間：2020-11-2

蛋白質是生命的基石，它們幾乎在地球的每一種生物中都能被找到，對我們的生存很重要。一些蛋白質例如抗體、酶、激素等會參與化學反應免疫過程以及細胞活動。蛋白質還在運動、結構支持、存儲能量、細胞消化、底物運輸等方面起作用。蛋白質由長鏈氨基酸組成，形成多種多樣，不同形狀大小的蛋白質。蛋白質因為其不同的長鏈氨基酸組成，每一種類型都有穩(wěn)定特別的三維結構。這種特殊的結構是至關重要的，每一個形狀的改變都會引起蛋白質功能的變化。所以說像蛋白質這種對熱敏感的分子，在分子下游分析過程之前的樣品制備就顯得格外重要。Precellys Evolution結合Cryolys Evolution冷卻系統(tǒng)能夠有效的在研磨過程中使研磨腔室溫度穩(wěn)定保持在4℃。

使用Precellys提高組織蛋白質的提取量

APPNOTE 1：從大鼠皮膚組織提取蛋白質沉淀和脂肪

APPNOTE 2：使用Minilys從小鼠心臟組織從提取蛋白質

Protocol 1：大體積大腸桿菌中提取蛋白質

Protocol 2： 96通道眼睛組織中提取蛋白質

APPNOTE 1

從*勻質的大鼠皮膚組織中提取蛋白質沉淀和脂肪

本應用中研究了從大鼠皮膚組織中提取蛋白質沉淀和有生物活性的脂肪。本應用中利用固相萃取與液相色譜質譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）來測組織中脂肪含量。大鼠皮膚組織使用Precellys Evolution生物樣品研磨器和Cryolys冷卻系統(tǒng)進行研磨，配合7mlCKMix50_研磨管。此外還測試了在大鼠組織整個研磨的過程結束后，樣本溫度都在40℃以下。

實驗材料

自動研磨器：Precellys Evolution生物樣品研磨器和Cryolys冷卻系統(tǒng)；

研磨管：CKMix50_7ml（Cat #: KT03961-1-306.7）；

組織樣本：大鼠皮膚組織（后足背側和腹側）；

干冰；

Buffer：甲醇。

實驗方法

20-90mg成年大鼠皮膚組織（后足背側和腹側），7ml研磨管加2.8mm和5.0mm陶瓷珠，500µL甲醇；轉速8000rpm，5個循環(huán)，每個循環(huán)10s，循環(huán)之間間歇120s；Cryolys冷卻系統(tǒng)將腔室內溫度降至5℃時開始研磨；研磨結束之后立即使用溫度探針檢測樣本管內的溫度。

實驗結果

如下圖1、2所示，圖1中a、b分別為研磨前與研磨后效果對比，結果顯示皮膚樣本被充分研磨；圖2為樣本被勻質后經過固相萃取，用LC-MS/MS技術檢測，成功檢測到花生四烯酸，5-HETE、8-HETE、9-HETE的濃度分別為1.3 ±0.3、7.9±0.6和1.3 ± 0.4 ng/mg。

實驗結論

大鼠的后爪皮膚比背部皮膚厚，因此獲得其完整勻質的難度更大，使用Precellys Evolution生物樣品研磨器，結合Precellys裂解試劑盒成功研磨大鼠后爪皮膚組織。本應用同樣也展示了Cryolys冷卻系統(tǒng)能夠保證樣本溫度在40℃以下。

APPNOTE 2

使用Minilys從小鼠心臟組織中提取蛋白質

開曼化學研究和生產抗體，為了營造更好的研究市場。為了保證質量，需要合適的組織裂解產物來確保我們的產品達到或者超過我們質量控制的標準。我們很多目標蛋白都是多通道跨膜受體，因此需要一個非常強力的裂解系統(tǒng)。

實驗材料

Minilys生物樣品研磨器；CKMix 2mL (KT03961-1-009.2)研磨管；920mg小鼠心臟組織；裂解Buffer：920µL M-PER (Mammalian Protein Extraction Reagent, Pierce)。

實驗方法

Minilys研磨參數：研磨速率5000rpm；4個循環(huán)，每個循環(huán)20s，循環(huán)之間間歇5s；

分析方法：使用Minilys研磨樣本之后，從中提取細胞質和膜蛋白；HEK 293細胞（S1P3轉染和未轉染）在細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，隨后提取蛋白質；所有的蛋白通過BCA法測定，溶菌產物通過Western Blot分析。

結果如圖所示：圖1為使用S1P3多克隆抗體；一列為3µLMark，第二列為2.5μgS1P3轉染過的HEK293細胞裂解產物，第三列為5μgS1P3轉染過的HEK293細胞裂解產物，第4列為50μg小鼠心臟膜蛋白裂解產物。結果顯示均有很好的條帶，研磨提取效果好。圖2為使用一種視神經多克隆抗體（C-Terminal）；一列為3µLMark，第二列為60μgHEK293細胞裂解產物，第三列為40μgHEK293細胞裂解產物，第四列為50μg小鼠心臟細胞質裂解產物，第五列為小鼠心臟膜蛋白裂解產物，結果顯示均有很好條帶，研磨提取效果好。