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Precellys：助力脾臟與肉芽瘤中兩種朊病毒株的檢測(cè)
朊病毒是可以引起多種嚴(yán)重的神經(jīng)性退行性疾病的蛋白質(zhì)，包括牛海綿狀腦病，也是我們常說(shuō)的瘋牛病。
據(jù)報(bào)道，從目前一些感染的動(dòng)物看，一些朊病毒株在神經(jīng)系統(tǒng)聚集之前，會(huì)首先在淋巴組織進(jìn)行復(fù)制和聚集。這個(gè)現(xiàn)象成為嗜淋巴細(xì)胞現(xiàn)象，在朊病毒入侵神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)起到重要作用。相反其他的朊病毒株在淋巴組織中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象。
大量文獻(xiàn)表明淋巴組織中朊病毒的復(fù)制是需要樹(shù)突狀細(xì)胞（FDCS）。令人驚訝的是，朊病毒可以在肉芽瘤中被發(fā)現(xiàn)，然而肉芽瘤是一種可能因?yàn)槿狈?shù)突狀細(xì)胞而引起的炎癥癥狀，這對(duì)于朊病毒如何入侵淋巴組織和炎癥組織就有了新的問(wèn)題。
本研究中檢測(cè)了兩種結(jié)構(gòu)特征相似，不同嗜淋巴細(xì)胞現(xiàn)象的朊病毒株，C-BSE和L-BSE。結(jié)果也表明朊病毒在脾臟和肉芽瘤中有聚集的能力。
實(shí)驗(yàn)材料與程序
1.實(shí)驗(yàn)建立
在接種朊病毒之前的21天和42天，對(duì)綿羊PrP轉(zhuǎn)基因（tg338）老鼠皮下注射PBS/CFA來(lái)誘導(dǎo)肉芽瘤的產(chǎn)生。在第0天對(duì)這些老鼠接種感染了C-BSE和L-BSE的老鼠腦漿（腦內(nèi)接種）。在接種后的不同時(shí)間收集大腦、脾臟、肉芽瘤樣品，并對(duì)這些樣品分別進(jìn)行免疫熒光或Western Blot檢測(cè)（圖1）。
2.免疫印跡
收集的組織樣本使用法國(guó)Bertin公司的Precellys生物樣品研磨器進(jìn)行研磨，2ml的研磨管，緩沖液含5%葡萄糖，搭配1.2mm的陶瓷研磨珠（也可以使用CK14研磨試劑盒），研磨程序如下：
脾臟：研磨轉(zhuǎn)速6500rpm，研磨時(shí)間45s，2個(gè)循環(huán)（Precellys Evolution可以使用8800rpm）
肉芽瘤：研磨轉(zhuǎn)速6500rpm，研磨時(shí)間45s，2個(gè)循環(huán)（Precellys Evolution可以使用8800rpm）
腦組織：研磨轉(zhuǎn)速6500rpm，研磨時(shí)間45s，1個(gè)循環(huán)（Precellys Evolution可以使用8800rpm）
組織勻漿里可以針對(duì)脾臟組織或肉芽瘤比較小的組織將葡萄糖含量從5%調(diào)整到10%或20%。樣本放在Criterion XT（Bio-rad，美國(guó)）凝膠上跑樣，電子信號(hào)傳遞到纖維膜（Bio-rad），使用生物素化的Sha31 anti-PrP單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
如圖2所示，在受C-BSE和L-BSE感染的老鼠腦組織、脾臟、肉芽瘤中不同天數(shù)顯示的PrP朊病毒檢測(cè)結(jié)果。L-BSE是有嗜淋巴細(xì)胞現(xiàn)象的朊病毒株，C-BSE是沒(méi)有嗜淋巴細(xì)胞現(xiàn)象的朊病毒株。其中在第43天時(shí)，在受L-BSE感染的脾臟和肉芽瘤中均檢測(cè)到了朊病毒，但在腦組織中沒(méi)有檢測(cè)到；在第85天時(shí)受C-BSE感染腦組織中檢測(cè)到了朊病毒；在第132天時(shí)，受感染腦組織中檢測(cè)到了大量的朊病毒聚集；結(jié)果表明受L-BSE這種有嗜淋巴細(xì)胞現(xiàn)象的朊病毒株感染的脾臟和肉芽瘤，也是會(huì)先在脾臟和肉芽瘤組織中產(chǎn)生朊病毒的復(fù)制，之后影響腦組織。
結(jié)論
L-BSE和C-BSE兩種朊病毒株雖然有相似的生物特性，但有不同的嗜淋巴細(xì)胞現(xiàn)象。我們從本研究中看出收到L-BSE感染的老鼠，在脾臟和肉芽瘤中都有朊病毒的聚集。另一方面在肉芽瘤中并沒(méi)有檢測(cè)到C-BSE朊病毒。這些結(jié)果表明對(duì)淋巴組織有依賴(lài)性的朊病毒株同時(shí)也對(duì)肉芽瘤有影響。使用法國(guó)Bertin公司的Precellys生物樣品研磨器可以高效研磨例如脾臟、腦組織、肉芽瘤等樣本，之后通過(guò)Western Blot完成檢測(cè)。此外，與Precellys搭配的Cryolys制冷系統(tǒng)可以快速降溫，保證在研磨的同時(shí)準(zhǔn)確控制研磨腔室溫度穩(wěn)定在0-10℃，為RNA和蛋白質(zhì)的提取保駕護(hù)航。