土壤堿性磷酸酶（S-AKP/ALP）活性測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
土壤磷酸酶是一類催化土壤有機磷化合物礦化的酶，其活性的高低直接影響著土壤中有機磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性，是評價土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強度的指標。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH顯著影響。通常按照其最適pH范圍，分為堿性、中性和酸性三種類型磷酸酶。
測定原理：
堿性環(huán)境中，S-AKP/ALP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，通過測定酚的生成量即可計算出S-AKP/ALP活性。
自備儀器和用品：
可見光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水、無水乙醇和甲苯。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1瓶，4℃避光保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。用前加100mL蒸餾水充分溶解。
試劑三：液體×1瓶，4℃保存。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加576μL無水乙醇（自備），24μL蒸餾水充分溶解。（變褐色后不能再使用）
標準品：液體×1瓶，0.5μmol/mL苯酚標準液，4℃保存。
催化反應(yīng)：
稱取風干混勻土壤約0.1g，加入50μL甲苯（自備），輕搖15min；加400μL試劑一并且搖勻后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，開始計時，催化反應(yīng)24h；到時后迅速加入1mL試劑二充分混勻，以終止酶催化的反應(yīng)。8000g，25℃離心10min，取上清液置于冰上待測。
顯色反應(yīng)：
1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到660 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管：取微量玻璃比色皿/酶標板，加入10μL蒸餾水，20μL試劑三，4μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水166μL，混勻后25℃靜置30 min，于660 nm測定吸光度，記為A空白管。
3. 標準管：微量玻璃比色皿/酶標板，加入10μL標準液，20μL試劑三，4μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水166μL，混勻后25℃靜置30 min，于660 nm測定吸光度，記為A標準管。
4. 測定管：微量玻璃比色皿/酶標板，加入10μL上清液，20μL試劑三，4μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水166μL，混勻后25℃靜置30 min，于660 nm測定吸光度，記為A測定管。
注意：空白管和標準管只需測定一次。
S-ALP活性計算公式：
活性單位定義：37℃中每克土壤每天釋放1μmol酚為1個酶活單位。
S-AKP/ALP（μmol/d/g 土樣）=[C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V總÷W÷T
= 0.725×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)÷W
C標準液：0.5μmol/mL；V總：催化體系總體積，1.45mL；W：土壤樣品質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時間，24 h=1 d。
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