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實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量原理
閱讀：694 發(fā)布時(shí)間：2023-5-15
實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR) 是一種用于實(shí)時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針，當(dāng)與擴(kuò)增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)出信號(hào)，從而可以對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達(dá)分析、病毒載量定量和基因突變檢測(cè)等應(yīng)用。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR是利用熒光信號(hào)的變化，實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。
1．?dāng)U增曲線
在實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)程中，通過(guò)熒光定量PCR儀，在PCR每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集，以熒光強(qiáng)度為縱軸，循環(huán)次數(shù)為橫軸，所得到的曲線稱(chēng)為PCR的擴(kuò)增曲線。
2．熒光閾值
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的前面十多個(gè)循環(huán)，熒光強(qiáng)度變化不大，熒光強(qiáng)度的平均值可稱(chēng)為基線值，在基線值的基礎(chǔ)上，增加一定數(shù)量后得到一熒光值，這一點(diǎn)后，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，因此稱(chēng)該值為熒光閾值。一般取PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)。
3．Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線
Ct值是指PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ct值與反應(yīng)管內(nèi)的模板數(shù)密切相關(guān)，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。