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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

煙粉虱(Bemisiatabaci)是世界性的農(nóng)業(yè)害蟲，能傳播 30 多種植物上的 70多種病毒病。煙粉虱感染的主要癥狀是感病后植株矮化、黃化、褪綠斑駁及卷葉；有的作物葉片變小，葉面皺縮，中部稍凸起，邊緣上卷，葉縮成球型。多種研究證明，煙粉虱是許多蔬菜病毒病的重要傳毒介體，尤以傳播雙體病毒組的病毒最甚，傳播種類多達(dá) 40 余種；煙粉虱以持久性方式傳毒，在有毒寄主植物上取食10-60 分鐘后就可傳毒，一旦獲得毒性，就可連續(xù)傳毒 20 天。煙粉虱的寄主植物廣泛，爆發(fā)時(shí)威脅農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)傳播植物病毒病，造成農(nóng)作物  減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)的嚴(yán)重后果。因此快速檢測(cè)煙粉虱具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以  探針法 qPCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)煙粉虱的試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到 100 拷貝/?L。

3.提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)煙粉虱 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 ?L 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

7.煙粉虱探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿足一定規(guī)模的檢測(cè)需求。

檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)熒光PCR，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液、超純水、煙粉虱探針法 qPCR 引物-探針混合干粉、煙粉虱探針法 qPCR 陽性對(duì)照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊(cè)。

自備試劑

樣品 DNA。

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/ ?L 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能

污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本  產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 ?L 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭， 下同。

3.在 6 號(hào)管中加入 5 ?L 1×10E7 拷貝/?L 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/?L 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 ?L 1×10E6 拷貝/?L 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/?L 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 ?L 1×10E5 拷貝/?L 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/?L 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性

對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10 ?L 上步所得 4 號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積  一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)DNA- 提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20 ?L 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)

用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)  置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好  后最后加）：

成分樣品管

N+2 個(gè)PCR 陰性

對(duì)照管標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品管（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix10 ?L10 ?L各 10 ?L

煙粉虱探針法

qPCR 引物-探針混合液3 ?L3 ?L各 3 ?L

N+2 個(gè)待測(cè) DNA 模板7 ?L不加不加

超純水不加7 ?L不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液

（1-6 號(hào)）

不加

不加各 7 ?L（1 號(hào)樣到 1

號(hào)管，2 號(hào)樣到 2 號(hào)管…）

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

過程溫度時(shí)間

預(yù)變性95℃2 min

PCR 反應(yīng)

（45 個(gè)循環(huán)）95℃15 sec

58℃30sec（采集 FAM 通道的熒光

信號(hào)，淬滅基團(tuán)為 TAMRA）

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 40，否則實(shí)驗(yàn)無效。如果實(shí)驗(yàn)有效，則分析待測(cè)樣品，如果無

Ct 或 Ct 大于或等于 40，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽性。

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