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產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品為 DNA 5’末端標(biāo)記系統(tǒng)，利用 T4 Polynucleotide Kinase（T4 多聚核苷酸激酶）和［γ-32P］ATP 對粘性末端或平末端的 DNA 或 RNA 的 5’末端進(jìn)行高效標(biāo)記反應(yīng)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.使用本試劑盒之前，不需要對 5’末端的磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸化處理，因為使用的kinase 能使 5’末端的磷酸與[γ-32P]ATP 的γ-磷酸進(jìn)行交換。

2.合成的單鏈或雙寡核苷酸的 5’末端游離的 OH 基團(tuán)都能通過 Kinase 反應(yīng)被標(biāo)記

（或者只是簡單的磷酸化）。

3.提供的兩種反應(yīng)液使交換反應(yīng)和磷酸化反應(yīng)都能高效進(jìn)行， 均能得到大于106cpm/pmol（5’﹣end）的比活性。

4.快速，最快 25 分鐘即可完成標(biāo)記反應(yīng)。

5.本產(chǎn)品足夠 20 次 20?L 體系的填入法標(biāo)記實(shí)驗。

6.DNA 5’末端磷酸化試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝

T4 多聚核苷酸激酶

（10 U/μL）20 ?L0.5mL 綠蓋管

5×交換反應(yīng)緩沖液100 ?L0.5mL 紅蓋管

10×磷酸緩沖液50 ?L0.5mL 黃蓋管

Control DNA20 ?L0.5mL 藍(lán)蓋管

使用手冊1 份無

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

DNA 片段、［γ-32P］ATP 或其它的標(biāo)記、未標(biāo)記的 ATPs、牛小腸堿性磷酸。

使用方法：

一、交換反應(yīng)

1.實(shí)驗前需自備的試劑：7M 醋酸銨、100%乙醇、70%乙醇等

2.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

注：5 pmoles 的 5’末端約等于 0.17μg 的長 100bp 的雙鏈 DNA。

3.37℃反應(yīng) 30 分鐘。

4.70℃加熱 5-10 分鐘使酶失活。

5.加入 10μL 的 7M CH3COONH4（pH 4.5）。如使用 CH3COONa 做乙醇沉淀時使其終濃度達(dá) 300mM。

6.  加入 87.5μL（2.5 倍）的冷無水乙醇，-20℃放置 30-60 分鐘。

7.離心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。

8.用適當(dāng) Buffer 溶解沉淀。

注：通過第 5-8 步操作幾乎可以除去大部分未反應(yīng)的[γ-32P] ATP，如要完-全其除去時，乙醇沉淀后用凝膠過濾等方法精制即可。如需用苯-酚抽提除去蛋白質(zhì)時， 請在第 8 步之后進(jìn)行。

二、磷酸化反應(yīng)標(biāo)記

A.去磷酸化反應(yīng)

9.實(shí)驗前需自備的試劑：TE 飽和酚/氯仿、3M NaCl、100%乙醇、70%乙醇、牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）等。

10.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分用量

自備的 DNA 片段133 μL(≤10 μg)

1 M Tris-HCl，pH 8.015 μL

牛小腸堿性磷酸酶

（CIAP，10~20 U/μL）2 ?L

滅菌的超純水補(bǔ)水至 150 ?L

總體積150 μL

11.50℃反應(yīng) 30 分鐘。

12.加入 150 μL 的 TE 飽和酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），充分混勻。

13.離心，取上層（水層）移到另一個微量離心管中。

14.重復(fù)操作 12-13。15.

16. 加入 7.5μL 的 3M NaCl（最終濃度 150mM）。

17. 加入 375μL（2.5 倍量）的冷無水乙醇，-20℃放置 30-60 分鐘。

18.離心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。

19.使用 20μL 的 TE Buffer 溶解沉淀。 B.磷酸化反應(yīng)（前反應(yīng)）

20.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

21.37℃反應(yīng) 30 分鐘。

22.下面的操作與交換反應(yīng)的第 4-8 步操作相同。

三、合成 DNA 寡核苷酸的標(biāo)記

23.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

24.37℃反應(yīng) 30 分鐘。

25.下面的操作與交換反應(yīng)的第 4-8 步操作相同。

26.當(dāng)摻入水平很低的時候，需要使用本步驟，即通過體積排阻色譜或過濾試劑盒除去未反應(yīng)的標(biāo)記。Sephadex G﹣50 層析柱（需另購）對于去除未摻入的 dNTPs 效果很好，它還能大幅減少小于 20 個堿基的DNA 寡核苷酸和小于 20bp 的雙鏈DNA 的量。使用之前需要在70℃加熱5-10 分鐘以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 層析柱可以用來純化長度不小于 10 個堿基的寡核苷酸。

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