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目前針對重組蛋白質(zhì)藥物中雜質(zhì)蛋白質(zhì)的 分類主要包含兩種： 1) 產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì) （Product-related impurities）；2) 過程相關(guān)雜 質(zhì)（Process-related impurities）[1] 。其中產(chǎn)品 相關(guān)雜質(zhì)主要是在生產(chǎn)和儲存過程中產(chǎn)生， 包括母藥降解產(chǎn)物、聚合物、翻譯后修飾 （脫氨、糖基化、二硫鍵錯配、氧化等）， 可通過肽圖及修飾、寡糖分析，二硫鍵解析 進行分析。而過程相關(guān)雜質(zhì)主要包括宿主細 胞蛋白質(zhì)（Host cell protein，HCP）、蛋白質(zhì) 純化中用到的Protein A等。

重組蛋白質(zhì)藥物一般由哺乳動物細胞表達 生產(chǎn)，生物制品中殘留的宿主細胞蛋白質(zhì) (HCP)作為外源蛋白質(zhì)可能在不同程度上引發(fā) 機體的免疫應(yīng)答，終導(dǎo)致過敏反應(yīng)或其他 不良反應(yīng)，因此必須建立合適的檢測HCP的方 法監(jiān)控生物制品的質(zhì)量。認識殘留HCP的風(fēng)險、 建立合適的殘留HCP檢測方法、控制生物制品 的質(zhì)量顯得尤為必要。 目前，上針對HCP 的殘留*尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，生物制藥公司采 用風(fēng)險控制(risk management)來設(shè)置HCP的殘 留*[2] 。美國 FDA規(guī)定, 用一種靈敏度較高 的方法檢測藥品中的 HCP, 其含量應(yīng)該低于檢 測限 ( 通常小于100 ppm) [3] 。國內(nèi)來看，《中 華人民共和國藥典》2010年版三部規(guī)定CHO細 胞殘余蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)含量的0.05%以下[4] 。 這提示研發(fā)單位在這個研發(fā)周期中需要將HCP 殘留作為重要的質(zhì)量控制項目。目前針對HCP 分析的主要難點在于成分復(fù)雜，可能包含上 千種殘留蛋白質(zhì)，其動態(tài)范圍為4至5個數(shù)量 級；另外，相對重組蛋白質(zhì)藥物，HCP含量較低（ppm級別），對檢測方法的靈敏度和動態(tài) 范圍要求較高。

宿主蛋白質(zhì)檢測方法不僅是保證生物制品 安全有效的關(guān)鍵, 也是生產(chǎn)過程控制和工藝優(yōu) 化的重要參數(shù)。目前, 宿主蛋白質(zhì)檢測方法常 用的HCP分析方法有十二烷基硫酸鈉-聚丙烯 酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、二維(2D)電泳、高 效液相層析(HPLC)、蛋白質(zhì)印跡(Western blot) 和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等[5] 。其中，ELISA 仍然是相對應(yīng)用較廣泛的HCP檢測方法, 主要 是由于其技術(shù)相對簡單、靈敏度較高，并可 提供數(shù)字化的定量結(jié)果，便于設(shè)定檢測限度 和建立技術(shù)規(guī)范。但是ELISA方法也存在一系 列的缺點，比如動態(tài)范圍較窄（<100），存 在抗體交叉反應(yīng)帶來的結(jié)果誤判，且開發(fā)周 期長, 費用高 (>$100K)、失敗風(fēng)險高，商品化 的試劑盒無法涵蓋所有過程特異性的HCP無法 發(fā)現(xiàn)由于工藝改變等引起的新出現(xiàn)的HCP蛋白 質(zhì)的等問題。

與傳統(tǒng)的ELISA方法相比，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）方法具有開發(fā)時間短（只需幾 周），可特異性地對所有HCP進行確證和定量， 對所有雜質(zhì)蛋白質(zhì)無偏性檢測，且方法動態(tài) 范圍高（可達6個數(shù)量級），方法調(diào)整快等優(yōu) 點。因此液質(zhì)聯(lián)用分析HCP已經(jīng)成為業(yè)內(nèi)關(guān)注 的熱點。但是，HCP實驗面對的是蛋白質(zhì)種類 眾多、復(fù)雜、樣品豐度差異巨大的分析對象， 并且需要獲得蛋白質(zhì)定性與定量的完整信息， 因此對質(zhì)譜硬件要求*。但從另一方面看， HCP所面臨的復(fù)雜體系蛋白質(zhì)鑒定與定量任務(wù)，

雜蛋白質(zhì)組學(xué)中的大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定與定量 工作的分析任務(wù)*一致。甚至，在蛋白質(zhì) 組學(xué)迅猛發(fā)展的十年間，實驗人員已經(jīng)對更 為復(fù)雜的樣本體系，如血漿、肝臟、腦、尿 等進行了深入分析。因此，*可以借鑒蛋 白質(zhì)組學(xué)積累的豐富的質(zhì)譜使用經(jīng)驗。

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，靜電場軌道阱 (Orbitrap) ，是業(yè)內(nèi)*的分辨率高、質(zhì)量精 度準(zhǔn)、靈敏度高、動態(tài)范圍寬的質(zhì)量分析器。 其中Q Exactive是四極桿和orbitrap的組合質(zhì)譜 平臺，其不但具有異常強大的蛋白質(zhì)鑒定能 力[6] ，而且Q Exactive還*顛覆了傳統(tǒng)對高 分辨質(zhì)譜定量能力不足的認識，次在一 個儀器平臺同時兼顧了的定性與定量性 能。而且其小巧的體積，簡單的操作，維護 便捷，使得高分辨質(zhì)譜能夠進入更多的實驗 室。

圖1為單抗產(chǎn)品的HCP液質(zhì)分析策略示意 圖。實驗分為兩個部分。首先是HCP的鑒定與 初步定量。在這一步，為了降低實驗難度， 不需要使用已經(jīng)完成所有純化步驟的產(chǎn)品作為樣品，而是使用上游的半成品分析。其中， 剛完成離心富集，以及剛經(jīng)過Protein A純化得 到的中間產(chǎn)品是較為理想的分析對象。這是 因為，這兩個步驟的樣品中，HCP的相對豐度 較成品高，而利于HCP的鑒定發(fā)現(xiàn)。當(dāng)獲得 HCP及其特征肽段的列表后，就可以使用這些 信息進入第二步驟——HCP監(jiān)控分析。在這一 步，目標(biāo)分析物為終產(chǎn)品，并采用以對目 標(biāo)蛋白質(zhì)進行定量為目標(biāo)的定量質(zhì)譜法— —選擇離子監(jiān)控質(zhì)譜法或平行反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜法。

在HCP鑒定發(fā)現(xiàn)步驟中，主要采用DDA （Data Dependent Acquisition）質(zhì)譜法進行蛋 白質(zhì)的鑒定，一級采用全掃描模式，二級譜 圖根據(jù)一級譜圖中不同質(zhì)荷比離子的強度信 息（Top N）依次進行觸發(fā)。Q Exactive采集速 度高達12Hz，具有蛋白質(zhì)鑒定能力。 Matthew等以酵母細胞為分析對象，在四小時 的分析時間內(nèi)，Q Exactive可同時鑒定到4,206 個蛋白質(zhì)，動態(tài)范圍達5個數(shù)量級，并且可鑒 定到豐度極低的蛋白質(zhì) （ less than 50 copies/cell）[7] 。其高通量、寬動態(tài)范圍、高 靈敏度的特點非常適合于重組蛋白質(zhì)藥物中雜質(zhì)蛋白質(zhì)的高通量定性要求。另外，可利 用一級質(zhì)譜圖中雜質(zhì)蛋白質(zhì)特征肽段的峰面 積進行相對定量，這樣就可同時完成雜質(zhì)蛋 白質(zhì)的鑒定和定量。定量方法如iBAQ蛋白絕 對定量算法。此方法將所有蛋白多肽的質(zhì)譜 響應(yīng)強度加權(quán)平均，并利用48種標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋 白測定的校正曲線自動校準(zhǔn)，終獲得樣本 中蛋白的含量，動態(tài)范圍可達6個數(shù)量級 相應(yīng)工作已于2011年發(fā)表在了Nature主刊中[8] 。 免費的MaxQuant蛋白分析軟件內(nèi)置了iBAQ定 量功能，可以輕松、地獲得目標(biāo)蛋白在 樣品中的相對豐度。

在殘留宿主細胞蛋白質(zhì)分析的第二步（對 已鑒定的HCP進行目標(biāo)監(jiān)控與定量）實驗中， 平行反應(yīng)監(jiān)測法（PRM）的表現(xiàn)更為突出。 PRM法是基于Q Exactive基礎(chǔ)的目標(biāo)蛋白質(zhì)定 量方法。它不但具有高靈敏度、寬線性范圍、抗基質(zhì)噪音能力強、同時定性定量、方法設(shè) 置簡單、無需方法優(yōu)化等性能優(yōu)點[9] 。加之僅 在一個Q Exactive平臺就可完成HCP的全部分析 任務(wù)。因此還具有了高性價比的經(jīng)濟優(yōu)勢。 在HCP的質(zhì)譜分析實例中，Katrin等人使用 Orbitrap型質(zhì)譜監(jiān)控重組蛋白質(zhì)藥物純化過程 中宿主蛋白質(zhì)的變化，并在終藥物中鑒定 到多種低豐度的宿主蛋白質(zhì),對蛋白質(zhì)純化方 法的優(yōu)化具有重要參考意義[10] 。

綜上，Q Exactive在一個儀器平臺上實現(xiàn) 了重組蛋白質(zhì)藥物宿主細胞蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)鑒 定及定量監(jiān)測要求，并與專業(yè)蛋白質(zhì)解析軟 件組成蛋白質(zhì)藥物雜質(zhì)蛋白質(zhì)分析完整解決 方案，技術(shù)流程簡單、成熟、通過了大量的 高水平研究與實踐，非常適合生物制藥企業(yè) 在研發(fā)周期中將其作為殘留HCP質(zhì)量控制的質(zhì) 譜分析平臺。

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