藥典液相色譜方法的調(diào)整

根據(jù)藥典附錄“液相色譜法”規(guī)定，可調(diào)整適當(dāng)參數(shù)
    ---調(diào)整目的：滿足系統(tǒng)適用性的要求
    ---系統(tǒng)適用性的要求
    ---HPLC方法調(diào)整的考慮因素
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
     1、理論塔板數(shù)：
           ----反映整個色譜系統(tǒng)的狀態(tài)
                      填料狀態(tài)
                      管線連接
                ----有不同的計算方法
                     主要是峰寬取值方法不同
                     不同計算方法計算結(jié)果有差異
                ----影響因素：
                     被測組分的保留時間、進(jìn)樣量等
                     積分參數(shù)
                     系統(tǒng)死體積
                     測定色譜方法、樣品與計算方法保持恒定，以便比較
                     
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
     2、分離度：
           ---影響因素：
                     *    影響柱效的因素
                           色譜柱尺寸
                           填料性能
                           進(jìn)樣量
                     *    影響分離選擇性的因素
                           流動相組成
                           色譜柱品牌
                           柱溫
                      *   柱外體積
                  ---有不同的計算方法，結(jié)果有差異
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
  3、重復(fù)性（進(jìn)樣精密度）：
            *   外標(biāo)法：對照品溶液（n：5）
                       峰面積RSD：2.0%
                 *    內(nèi)標(biāo)法：相當(dāng)于80%，100%，120%的對照品溶液，加入規(guī)定量內(nèi)標(biāo)
                                       溶液，分別至少進(jìn)樣2次，計算平均校正因子（n：6）
                       校正因子RSD：2.0%
                 *    手動進(jìn)樣器：定量環(huán)（滿環(huán)進(jìn)樣：進(jìn)樣體積至少為3倍定量環(huán)體積）
                       自動進(jìn)樣器：準(zhǔn)確定量范圍
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
  4、拖尾因子：
            ----影響因素：
                  *    與理論塔板數(shù)相關(guān)的因素：
                         色譜柱選擇、流動相、進(jìn)樣量、積分參數(shù)等
                  *     與檢測品種與方法相關(guān)
                  *      峰高法定量分析：0.95~1.05
                     

HPLC方法參數(shù)調(diào)整
用規(guī)定的對照品對色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗，應(yīng)符合要求。
     如達(dá)不到要求，可對色譜分離條件做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
不得改變：固定相種類，流動相組成，檢測器種類。
可改變：色譜柱尺寸，牌號，填料粒度，流動相流速，流動相各組成的比例，梯度洗脫時間長度，柱溫，進(jìn)樣量，檢測器靈敏度等
常見的液相色譜參數(shù)的調(diào)整：其他參數(shù)
柱溫：升高柱溫有利于改變峰形和分離度，但要注意柱的zui高耐受力
進(jìn)樣量：在滿足檢測要求的前提下，盡量減少進(jìn)樣量
供試品溶劑：溶劑強度應(yīng)等同或低于流動相洗脫強度
反相色譜中溶解樣品的溶劑：
     *    甲醇并不是良溶劑
     *    推薦溶劑
           是流動相
           梯度為起始流動相
           盡可能有水溶液參與
           如果不得不用有機溶劑溶解，盡可能使用小進(jìn)樣量或兩步稀釋 
常見的液相色譜參數(shù)的調(diào)整：流動相
改變?nèi)軇┍壤焊鶕?jù)色譜柱類型與狀態(tài)
添加劑
     掃尾劑：有機胺
     緩沖溶液：10-50mM；從20mM開始，越少越好
     離子對試劑：平衡時間長，易在色譜柱中保留
緩沖液pH
     酸含量
     緩沖液的緩沖容量：pKa+-1
     對方法耐用性的影響
常見的液相色譜參數(shù)的調(diào)整：固定相
關(guān)注不同品牌色譜柱的選擇性差異
      堿性化合物：封端柱、內(nèi)嵌極性基團(tuán)柱
      pH耐受范圍
      耐受高水相柱：阿莫西林含量及有關(guān)物質(zhì)的測定
關(guān)注色譜柱規(guī)格對分離的影響
     長度：
     內(nèi)徑：可決定流速
     粒度：越小，柱效越高
     孔徑：與樣品分子量大小相關(guān)

藥品雜質(zhì)分析：雜質(zhì)定義
任何影響藥品純度的物質(zhì)
在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)系指在按照經(jīng)國家有關(guān)藥品監(jiān)督管理部門依法審查批準(zhǔn)的規(guī)定工藝和規(guī)定的原輔料生產(chǎn)的藥品中，由其生產(chǎn)工藝和原輔料帶入的雜質(zhì)，或經(jīng)穩(wěn)定性試驗確證的在貯存過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。
藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)不包括：
     *    變更生產(chǎn)工藝或原輔料而產(chǎn)生的新的雜質(zhì)：重新申報
     *    摻入或污染的外來物：假劣藥品，非法定方法予以檢測
液相色譜法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查
儀器要求：
      檢測靈敏度
      檢測手段-專屬性
      數(shù)據(jù)處理：積分參數(shù)（zui小峰高和zui小峰面積設(shè)定）
已知雜質(zhì)：采用對照品或相對保留時間定位
專屬性：采用DAD確定UV紫外光譜或不同波長的響應(yīng)情況
定量：已知雜質(zhì)雜質(zhì)：測定對主成分的相對響應(yīng)因子
                 未知雜質(zhì)：主成分自身對照法
雜質(zhì)確定
可用DAD、MSD確定雜質(zhì)峰的數(shù)目
用空白試驗排除干擾
     *    空白溶劑進(jìn)樣（考慮進(jìn)樣溶劑的影響）
     *     運行空白梯度（考慮流動相溶劑質(zhì)量的影響）
降低系統(tǒng)殘留的影響
     *    手動進(jìn)樣閥的清洗
     *     自動進(jìn)樣器應(yīng)采用洗針進(jìn)樣模式
考慮色譜分離方法的影響
      *     分離度、進(jìn)樣量
影響檢測器靈敏度的因素
檢測器
     *    流通池：體積大，靈敏度高
     *     紫外燈能量
     *     采樣頻率：大于15Hz時可準(zhǔn)確描述峰
死體積
     *    儀器連接管線應(yīng)盡量減小柱外體積，避免色譜峰的擴(kuò)散
     *     運行空白梯度（考慮流動相溶劑質(zhì)量的影響）
上樣量
流動相：在低波長檢測時，影響大