吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

脯氨酸是植物體內(nèi)適應逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同，分為谷氨酸( Glu) 和鳥氨酸( Orn) 兩條合成途徑。

吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS，Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）是以谷氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關鍵酶，對植物適應逆境脅迫起關鍵作用。

測定原理：

吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成 P5C 過程中分解ATP 生成ADP 和無機磷，通過鉬酸銨比色法測定單位時間內(nèi)產(chǎn)生無機磷的量可確定P5CS 活性。

組成：

試劑四用時加入 25 ml 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周；試劑五用時加入 25 ml 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周；

0.5μmol/ml 標準磷應用液配制：

將試劑七 20 倍稀釋，即取 0.1ml 試劑七加 1.9ml 蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制：

按H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

自備儀器和用品：

可見外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣品酶液的制備：

1、組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入

1ml 試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

操作步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 660nm。

2、酶促反應（在EP 管中加入下列試劑）

混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）準確水浴 10min

混勻，8000g，25℃離心 10min，取上清液

3、定磷（在EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

混勻，室溫放置 30min，在 660nm 處，記錄各管吸光值。

注意：

1、由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒 50 管保證測 24 份P5CS 活性。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。

3、空白管和標準管只要做一管。每個測定管設一個對照管。

計算

1、血清（漿）P5CS 活力的計算:

單位定義：每小時每毫升血清（漿）中P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。

P5CS 活力（μmol/h/ml）=C 標準管×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）×V 總÷V 樣÷T=9

×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）

2、組織中P5CS 活力的計算：

（1） 按蛋白濃度計算：

單位定義：每小時每毫克組織蛋白中 P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。

P5CS 活力(μmol/h /mg prot)=C 標準管×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）×V 總÷（Cpr×V樣）÷T =9 ×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位定義：每小時每克組織中 P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。

P5CS 活力(μmol/h /g 鮮重)=C 標準管×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）×V 總÷(W× V

樣÷V 樣總)÷T=9 ×（A 測定管-A 對照管）÷（A 標準管-A 空白管）÷W

C 標準管：標準管濃度，0.5μmol/ml；V 總：酶促反應總體積，0.3ml；V 樣：加入樣本體積，0.1ml ； V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時間，1/6 小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重， g。