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內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基配方優(yōu)化：避免生長(zhǎng)不良問(wèn)題
內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial Cells）是構(gòu)成血管內(nèi)壁的單層扁平上皮細(xì)胞，形態(tài)呈多邊形，細(xì)胞的邊緣呈鋸齒狀并相互嵌合，覆蓋于動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管的內(nèi)表面，形成血液與周圍組織之間的機(jī)械屏障。作為血管系統(tǒng)的核心功能單元，內(nèi)皮細(xì)胞在基礎(chǔ)研究、疾病模型構(gòu)建、臨床診斷和藥物篩選等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
本期細(xì)胞學(xué)堂將為您詳細(xì)介紹內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能及分離培養(yǎng)步驟，幫助您快速了解內(nèi)皮細(xì)胞，順利展開(kāi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
01#
內(nèi)皮細(xì)胞類型的模塊化分布
內(nèi)皮細(xì)胞并非單一類型，而是根據(jù)血管功能與組織需求分化為不同亞型，形成模塊化分布格局。
連續(xù)型內(nèi)皮細(xì)胞（Continuous Endothelium）
結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：
基底膜連續(xù)，細(xì)胞間通過(guò)緊密連接（如Claudin、Occludin蛋白）形成完整的選擇性屏障。脂溶性小分子可自由擴(kuò)散，而親水性小分子和水則依賴特定的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制（如水通道蛋白）通過(guò)。
細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞間隙約為12 ?，大部分物質(zhì)運(yùn)輸依賴跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制（如囊泡介導(dǎo)的白蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)）。
細(xì)胞收縮性較弱，細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白分布相對(duì)稀疏，整體形態(tài)穩(wěn)定，通透性極低。
功能：
維持血腦屏障（BBB）、血-視網(wǎng)膜屏障等結(jié)構(gòu)完整，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受毒性物質(zhì)侵害。
典型分布：
大腦（血腦屏障）、心臟、肺、肌肉、皮膚。
窗孔型內(nèi)皮細(xì)胞（Fenestrated Endothelium）
結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：
細(xì)胞表面存在直徑約200-1000 ?的窗孔，大部分覆蓋由 PV-1蛋白形成的非膜性隔膜。這種結(jié)構(gòu)增加了細(xì)胞對(duì)流體和溶質(zhì)的通透性，但同時(shí)限制了大分子通過(guò)。
基底膜連續(xù)，允許小分子和液體的快速交換。
糖萼層在窗孔型內(nèi)皮表面較為稀疏，其殘留結(jié)構(gòu)仍可能參與微環(huán)境的調(diào)節(jié)和溶質(zhì)交換的選擇性控制。
功能：
參與物質(zhì)高效濾過(guò)（腎小球）、激素分泌（胰島毛細(xì)血管）和營(yíng)養(yǎng)吸收（胃腸道黏膜）。
主要分布：
腎臟（腎小球）、內(nèi)分泌腺（如胰島）、胃腸道黏膜。
不連續(xù)型/竇狀內(nèi)皮細(xì)胞（Discontinuous/Sinusoidal Endothelium）
結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：
基底膜不連續(xù)或缺失，細(xì)胞間間隙較大，可達(dá)0.1-1 μm。這種結(jié)構(gòu)支持大分子（如脂蛋白）和血細(xì)胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)運(yùn)，使其能夠進(jìn)入實(shí)質(zhì)組織。
細(xì)胞間連接較松散，可在局部信號(hào)（免疫分子、機(jī)械應(yīng)力）影響下調(diào)節(jié)血管孔隙大小，參與動(dòng)態(tài)過(guò)濾功能。
功能：
高通透性結(jié)構(gòu)支持大分子和血細(xì)胞交換，并在肝臟等器官中承擔(dān)免疫清除與調(diào)節(jié)功能。
主要分布：
肝臟、脾臟、骨髓等器官的血竇系統(tǒng)。
02#
內(nèi)皮細(xì)胞功能模塊化體系
不同組織中的內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)調(diào)整連接方式的組成和比例，適應(yīng)其特定的生理需求，從而維持血管系統(tǒng)的正常功能。
連接方式
緊密連接
由跨膜蛋白（如Occludin、Claudin）與胞質(zhì)錨定蛋白（如ZO-1）形成選擇性屏障，限制細(xì)胞間隙中溶質(zhì)的被動(dòng)擴(kuò)散，在血腦屏障等關(guān)鍵部位發(fā)揮核心作用。
縫隙連接
由 Connexin 蛋白構(gòu)成，允許相鄰細(xì)胞間直接傳遞離子、小分子及第二信使，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞功能的快速協(xié)同，如鈣信號(hào)和代謝物的同步傳播。
黏附連接
通過(guò)鈣黏蛋白（如VE-cadherin）與肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)合，維持細(xì)胞間機(jī)械穩(wěn)定性，并參與白細(xì)胞黏附與跨內(nèi)皮遷移，調(diào)控炎癥和免疫應(yīng)答過(guò)程。
分子標(biāo)志物
功能模塊 | 標(biāo)志分子 |
血管張力調(diào)節(jié) | 舒張因子：一氧化氮（NO）、前列環(huán)素（PGI2） |
收縮因子：內(nèi)皮素-1（ET-1）、血栓素A2（TXA2） | |
凝血與纖溶 | 抗血小板聚集：NO、PGI2 |
纖溶：組織型纖溶酶原激活物（tPA） | |
抗凝：肝素樣糖胺聚糖（Heparan sulfate proteoglycans）、肝素輔因子II（Heparin cofactor II） | |
促凝：血管性血友病因子（vWF）、血小板活化因子（PAF） | |
炎癥與免疫 | 黏附分子：細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1/VCAM-1） |
抗菌肽：防御素β（Defensin-β） | |
細(xì)胞因子：白介素37（IL-37） | |
血管生成與修復(fù) | 促血管生成：內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGF-A）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF） |
促血管修復(fù)：血管生成素-1（Ang-1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β） | |
維持血管結(jié)構(gòu) | 內(nèi)皮標(biāo)志物：CD31、鈣粘蛋白（VE-cadherin） |
結(jié)構(gòu)指標(biāo)：微血管密度（MVD） |
功能響應(yīng)
物質(zhì)交換功能
所有類型內(nèi)皮細(xì)胞均參與氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物交換，依其結(jié)構(gòu)采用跨細(xì)胞或旁細(xì)胞通道，如連續(xù)型內(nèi)皮細(xì)胞主要跨胞機(jī)制（如囊泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)）實(shí)現(xiàn)物質(zhì)交換。
力學(xué)響應(yīng)性
剪切應(yīng)力可激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS），促進(jìn)一氧化氮（NO）釋放，以擴(kuò)張血管，維持血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)態(tài)。
穩(wěn)定的脈動(dòng)血流能夠抑制炎癥因子表達(dá)，防止內(nèi)皮激活與功能紊亂。
病理可塑性
在氧化應(yīng)激、炎癥等病理?xiàng)l件下，內(nèi)皮細(xì)胞可發(fā)生功能障礙，表現(xiàn)為通透性增加、黏附分子表達(dá)上調(diào)等。這些變化參與了動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管病變等多種病理過(guò)程。
異質(zhì)性中的統(tǒng)一性
盡管不同組織器官間內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上存在差異顯著，但它們普遍表達(dá)一些共同的標(biāo)志物（如CD31、VE-cadherin），表現(xiàn)出一定的統(tǒng)一性。
內(nèi)皮細(xì)胞具有極性特征，頂端朝向血腔，基底面通過(guò)整合素等受體與基底膜結(jié)合，從而維持血管結(jié)構(gòu)的完整性。
03#
內(nèi)皮細(xì)胞的分離提取與培養(yǎng)
以分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為例，操作步驟如下：
01 血管處理
臍帶采集與清洗
采集新鮮臍帶，用無(wú)菌PBS沖洗去除表面血液。
血管識(shí)別與分離
沿臍帶縱軸切開(kāi)，識(shí)別單根臍靜脈（其直徑較大、壁薄，與兩條較厚且呈螺旋排列的動(dòng)脈區(qū)分）。用鑷子進(jìn)行鈍性剝離，去除周圍結(jié)締組織。
血管清洗與封閉
為防止殘留紅細(xì)胞和凝血-塊影響后續(xù)操作，用預(yù)冷PBS反復(fù)灌洗血管至流出液清澈（通常需5-8次）。隨后，用無(wú)菌手術(shù)夾封閉血管一端，另一端連接注射器，形成封閉系統(tǒng)以控制酶處理范圍。
02 消化與收集
將HUVEC專用消化酶緩慢注入血管，確保內(nèi)腔充盈。隨后將血管置于37℃孵育10-15 min（注意：孵育時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則易導(dǎo)致細(xì)胞死亡）。消化結(jié)束后，為防止消化液流出受阻，先用鈍頭針頭疏通血管下端流出口，隨后松開(kāi)下端手術(shù)鉗，消化液流入一個(gè)含有內(nèi)皮細(xì)胞完-全培養(yǎng)基的50 mL 無(wú)菌離心管中，再用完-全培養(yǎng)基沖洗血管內(nèi)腔，收集洗脫液。將收集液以150 × g離心5 min，離心結(jié)束后，分離的內(nèi)皮細(xì)胞聚集于離心管底部。小心棄去上清液，避免擾動(dòng)細(xì)胞沉淀。
03 接種與傳代
用完-全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞接種到預(yù)涂纖維連接蛋白、明膠或基底膜基質(zhì)的培養(yǎng)瓶，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁和鋪展，培養(yǎng)24-48 h后觀察細(xì)胞貼壁情況，換液后可見(jiàn)典型“單層扁平排列樣”內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。
04 常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
問(wèn)題 | 可能原因 | 解決方案 |
細(xì)胞得率低 | 酶消化不充分 | 優(yōu)化消化酶濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間 |
成纖維細(xì)胞污染 | 血管外膜未徹-底剝離 | 鈍性分離時(shí)避免損傷血管中膜 |
細(xì)胞貼壁率低 | 基質(zhì)涂層不均勻 | 預(yù)涂纖維連接蛋白 |
細(xì)胞提前衰老 | 傳代次數(shù)過(guò) | 限制傳代（≤5代） |
氧化應(yīng)激反應(yīng) | 添加抗氧化劑（如NAC） |
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參考文獻(xiàn)
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