合成肽的生產(chǎn)涉及多個步驟，包括脫保護、活化、偶聯(lián)和從固相支持體上切割最終序列。雜質(zhì)，例如因過早鏈終止或缺失氨基酸產(chǎn)生的雜質(zhì)，會影響最終產(chǎn)品的安全性和有效性，因此，必須通過液相色譜分析分離這些雜質(zhì)。在液相分析中，選擇合適的流動相和色譜柱對于各組分實現(xiàn)最佳分離至關(guān)重要。

采用島津LCMS-2050單桿質(zhì)譜儀，進行多種流動相、多柱的篩選，搭配LabSolutions MD軟件，有效提升合成肽相關(guān)雜質(zhì)方法開發(fā)的效率。

此次研究基于一種肽和五種具有不同序列的有關(guān)雜質(zhì)作為合成肽的模型樣品(表1)。制備全長肽(FLP:B-促黑素)、較短長度產(chǎn)物的 p.A1del、p.A1_E2del、p.A1_K3del 和 p.A1、D5del的缺失序列以及 Met(O2)(FLP 中的甲硫氨酸被氧化成甲硫氨酸砜)作為樣品。

色譜柱

Shim-pack Scepter C18-120

(1.9μm,3.0x100mm)

Shim-pack GISS C18

(1.9μm,3.0x100mm）

Shim-pack Velox SP-C18

(1.8μm,3.0x100mm)

Shim-pack Scepter C8

(1.9μm,3.0x100mm)

Shim-pack Scepter Phenyl

(1.9μm,3.0x100mm)

Shim-pack GIST HP C18-AQ

(1.9μm,3.0x100mm)

柱溫：40℃

樣品溶劑：水

流動相：

A：

Line A：0.1%三fu乙酸水溶液

Line B：0.1%甲酸水溶液

Line C：10mmol/L甲酸銨（pH=4）水溶液

Line D：10mmol/L乙酸銨（pH=5）水溶液

B：

Line A：乙腈

Line B：甲醇

流速：0.5mL/min

洗脫梯度：10%B（0min）→60%B（10 min）→10%B(10.01min-15min）

紫外檢測器：220 nm

質(zhì)譜系統(tǒng)：LCMS-2050

對比流動相和色譜柱的篩選結(jié)果，水相流動相和有機相流動相的組成對 FLP 及相關(guān)雜質(zhì)的分離有顯著影響?；贚abSolutions MD軟件計算評估值，如表2所示。從中選擇的分析條件進行進一步方法優(yōu)化。

進一步優(yōu)化柱溫，考察篩選出評估值最高的3個檢測條件下，柱溫對于分離的影響。使用 Scepter C8-120 色譜柱，采用 0.1%甲酸和甲醇的流動相，p.A1del和 FLP 之間的分離度更好。

80℃(①),70℃(②),60℃(③),50℃(④),40℃(⑤)(0.1%甲酸/甲醇/ScepterC8-120)

80℃(① ),70℃(②),60℃(③),50℃℃(④),40℃(⑤)(10mmol/L醋酸銨 /乙腈:甲醇=50:50 /Velox SP-C18)

80℃(①),70℃(②),60℃(③),50℃(④),40℃(⑤)(10mmol/L醋酸銨 /甲醇/Scepter C8-120)