發(fā)光細菌（luminescent bacteria.luminousbacteria），進行生物發(fā)光的細菌。多數(shù)為海生，與發(fā)光浮游生物同是引起海面發(fā)光的原因。此外，在空氣中，死魚及水產(chǎn)加工食品的表面于暗處也會發(fā)光，這種發(fā)光現(xiàn)象是海生菌第二次生長繁殖的結(jié)果。用加有3%NaCl，1%甘油的普通肉汁蛋白胨培養(yǎng)基可以培養(yǎng)。

一、知識介紹

發(fā)光細菌 luminescent bacteria.luminousbacteria，進行生物發(fā)光的細菌。多數(shù)為海生，與發(fā)光浮游生物同能引起海面發(fā)光。此外，在空氣中，死魚及水產(chǎn)加工食品的表面于暗處也會發(fā)光，這種發(fā)光現(xiàn)象導致海生菌的第二次生長繁殖。用加有3%NaCl，1%甘油的普通肉汁蛋白胨培養(yǎng)基可以培養(yǎng)。發(fā)光菌形態(tài)雖多種多樣，但生理特性卻非常相似。一般對明膠不產(chǎn)生液化，分解蛋白質(zhì)后不形成毒物，常寄生在各種動物體上引起“發(fā)光病”，即寄生發(fā)光。這些細菌通常經(jīng)由寄主的卵傳遞給后代寄主。有些發(fā)光魚類和烏賊是和發(fā)光細菌共生而利用了細菌的發(fā)光。明亮發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）可在牛馬的死尸和肉中繁殖；它侵入人體則會產(chǎn)生發(fā)光尿。這些細菌一般好低溫，溫度約為18℃，37℃以上則不發(fā)光。發(fā)光現(xiàn)象是酶促氧化反應，必需FM－NH2，O2長鏈飽和醛，蟲熒光素酶等。一般認為FMNH2就是熒光素。發(fā)光細菌有一百幾十種，除上述幾種外，典型的還有魚無色桿菌（Achromobac-ter fisheri）、磷光弧菌（Vibrio phosphoresce－ns）、發(fā)光桿菌（Bacillus photogenus）等。細菌發(fā)光的生物學意義與動物發(fā)光不同，還不十分清楚。根據(jù)具有可以抑制氯高鐵血紅素呼吸濃度的一氧化碳，而不能抑制其氧化過程這點來看，可以把它看作是不參與細胞色素系統(tǒng)的呼吸形式稱為發(fā)光呼吸。發(fā)光細菌發(fā)出青白色光，如魚無色桿菌所發(fā)出的光，波長為490納米。

目前國內(nèi)常用的3種發(fā)光細菌為：明亮發(fā)光桿菌、費氏弧菌、青?；【?。

其中以明亮發(fā)光桿菌在 GB/T15441-1995 水質(zhì) 急性毒性的測定 發(fā)光細菌法中所使用；

費氏弧菌在歐盟的標準中所使用；青海弧菌是在青海湖的魚體內(nèi)提取的菌種，屬淡水菌，在測試飲用水時有較大優(yōu)勢，并已申請凍干粉制作：ZL 97106203.X

該檢測方法在5.12汶川地震災區(qū)有了較大規(guī)模的應用，快速、便捷、綜合評價等優(yōu)點得到了充分發(fā)揮，受到了衛(wèi)生、環(huán)保、疾控部門的重視，國家也將其列入應急監(jiān)測項目。能夠提供此類設備的公司有北京濱松光子技術股份有限公司（國產(chǎn)技術）、荷蘭microLAN公司、美國SDI公司、以色列checklight公司等，詳細信息在其各自網(wǎng)站會有公布。

《發(fā)光細菌與環(huán)境毒性檢測》一書由朱文杰、鄭天凌、李偉民三位老師完成的作品，內(nèi)容主要介紹了發(fā)光細菌的發(fā)現(xiàn)及應用領域等信息，著重介紹了青海弧菌的發(fā)展過程，大家感興趣的話可以進行查閱！

二、菌種分類

發(fā)光細菌是一類在正常的生理條件下能夠發(fā)射可見熒光的細菌，這種可見熒光波長在450-490nm之間，在黑暗處肉眼可見。已命名的發(fā)光細菌有以下幾種：① 屬于異短桿菌屬（Xenorhabdus）的有發(fā)光異短桿菌（Xenorhabdus luminescens）；② 屬于發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）的有明亮發(fā)光桿菌（Photosbacterium phosphoreum）和鰒發(fā)光桿菌（P．1eiognathi）；③ 屬于希瓦氏菌屬（Shewanella）的有羽田希瓦氏菌（Shezoanella hanedai），以前也曾經(jīng)把它歸類為交替單胞菌屬（Alteromonas）的海氏交替單胞菌（Alteromonas hanedia）；④ 屬于弧菌屬（Vibrio）的有哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、美麗弧菌生物型I(V．splendidus biotype I）、費氏弧菌（V．fischeri）、火神弧菌（V．1ogei）和東方弧菌（V．orientalis）?；魜y弧菌（V．cholerae）和地中海弧菌（V．mediterranei）中的某些菌株有發(fā)光現(xiàn)象，曾有報道易北河弧菌（V．a(chǎn)lbensis）有發(fā)光現(xiàn)象，后將其重新分類歸入霍亂弧菌（V．cholerae）。另外，中國學者分離到一株淡水發(fā)光細菌命名為青?；【╒. qinhaiensis），還沒收入伯杰氏細菌手冊。

在以上發(fā)光細菌中，異短桿菌和青?；【鷮儆诘l(fā)光細菌，其它都是海洋細菌。發(fā)光細菌主要分布于海洋環(huán)境中。

三、發(fā)光機理

發(fā)光機理的研究表明，不同種類的發(fā)光細菌的發(fā)光機理是相同的，是由特異性的熒光酶（LE）、還原性的黃素（FMNH2）、八碳以上長鏈脂肪醛（RCHO）、氧分子（O2）所參與的復雜反應，大致歷程如下：

FM NH2+LE → FMNH2·LE+ O2 → LE·FM NH2·O2

+ RCH O →LE·FMNH2·O2·RCH0 → LE+ FM N +H2O+RCOOH+光

概括的說就是，細菌生物發(fā)光反應是由分子氧作用，胞內(nèi)熒光酶催化，將還原態(tài)的黃素單核苷酸（FMNH2）及長鏈脂肪醛氧化為FMN 及長鏈脂肪酸氧化，同時釋放出發(fā)光強度在波長為450-490nm處的藍綠光。其中三步反應產(chǎn)生三種中間產(chǎn)物，壽命極短，很難分離出來。

熒光素酶是生物體內(nèi)催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱，細菌熒光素酶是含α、β兩個多肽亞基的單加氧酶，只有兩個亞基共存時才有活性。從不同海洋細菌中提取到的細菌熒光素酶其分子量差別較小。王安平等分離純化了東方弧菌的熒光酶并對其酶學性質(zhì)進行了研究，分離得到了兩個分子量分別為44 kD和41 kD的亞基，該酶反應的溫度在l8℃ ，超過25℃酶即迅速失活。

四、應用分類

1、環(huán)境監(jiān)測

發(fā)光細菌由于其的生理特性，在環(huán)境監(jiān)測中被作為測定環(huán)境中毒物的指標。發(fā)光細菌在正常的生理條件下能發(fā)出波長在450～490nm 的藍綠色可見光，在一定的試驗條件下發(fā)光強度是恒定的。與外來受試物接觸后，由于毒物具有抑制發(fā)光的作用，發(fā)光細菌的發(fā)光強度即有所改變，變化的程度與受試物的濃度在一定范圍內(nèi)呈相關關系，同時與該物質(zhì)的毒性大小有關。外來受試物主要通過下面兩個途徑抑制細菌發(fā)光：① 直接抑制參與發(fā)光反應的酶類活性；②抑制細胞內(nèi)與發(fā)光反應有關的代謝過程。凡能夠干擾或破壞發(fā)光細菌呼吸、生長、新陳代謝等生理過程的任何有毒物質(zhì)都可以根據(jù)發(fā)光強度的變化來測定。利用發(fā)光細菌來檢測有毒物質(zhì)，由于有毒物質(zhì)僅干擾發(fā)光細菌的發(fā)光系統(tǒng)，發(fā)光強度的變化可以用發(fā)光光度計測出，費時較少且靈敏度高，操作簡便，結(jié)果準確，所以利用發(fā)光細菌的發(fā)光強度作為指標來監(jiān)測有毒物質(zhì)，在國內(nèi)外越來越受到重視，在環(huán)境監(jiān)測中的應用也越來越廣泛。

利用發(fā)光細菌毒性試驗檢測環(huán)境污染物急性毒性備受重視，中國于1995年將這一方法列為環(huán)境毒性檢測的標準方法（GB/T15441—1995）。相信這一技術會在中國的環(huán)保事業(yè)中發(fā)揮更大的作用。

2、生物傳感器

利用發(fā)光細菌制作生物傳感器，是人們研究的熱點之一。發(fā)光細菌的發(fā)光強度與某些污染物的濃度呈較好的線性關系，能夠穩(wěn)定、靈敏、快速地反映環(huán)境中污染物的濃度變化，因此，利用發(fā)光細菌制備識別元件，成為國內(nèi)外傳感器研究和發(fā)展的熱點。20世紀80年代初美國Beckman公司推出功能完備的生物毒性測試儀，它具有應用范圍廣，靈敏度高，相關性好，反應速度快等優(yōu)點，發(fā)光細菌毒性測試（Luminescent bacteria toxicitytest，L．B．T．）技術在世界范圍內(nèi)迅速推廣。細菌能夠穩(wěn)定、高效、持續(xù)發(fā)光是其被用做生物敏感材料來制備識別元件的基礎，因此篩選優(yōu)良的菌種是傳感器制作的關鍵之一。海洋發(fā)光細菌是海洋環(huán)境中的正常微生物，從海洋環(huán)境中分離優(yōu)良的發(fā)光細菌菌株是可行的。

3、基因組成

發(fā)光基因（lux gene）系統(tǒng)中包括結(jié)構基因luxC，D，A，B，E 和調(diào)節(jié)基因luxI和luxR 等。從不同發(fā)光細菌中分離得到的發(fā)光基因其種類和數(shù)量有所差異，例如luxF僅發(fā)現(xiàn)于明亮發(fā)光桿菌，但以上五個結(jié)構基因luxC，D，A，B，E 是普遍存在于已知的所有發(fā)光細菌中的。編碼菌熒光素酶的基因是luxA 和luxB，在lux操縱子中，luxA 和luxB 是緊密相連的。以哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）為例，其luxA 基因中含有1065bp，編碼的α亞基是355個氨基酸的多肽，分子量為40kD；luxB基因中含有972bp，編碼的β亞基是有324個氨基酸的多肽，分子量為36kD。由α、β兩亞基組成的熒光酶的分子量為76 kD。編碼脂肪酸還原酶(多肽轉(zhuǎn)移酶和還原酶）的luxC和luxD位于luxA、luxB基因的上游一側(cè)，編碼合成酶的luxE基因位于luxA，luxB基因的下游一側(cè)。luxC 含有1431bp，編碼的蛋白質(zhì)含有477個氨基酸，分子量為55 kD；luxD 編碼的蛋白質(zhì)分子量為33 kD；luxE編碼的蛋白質(zhì)分子量為42 kD。在明亮發(fā)光桿菌中還發(fā)現(xiàn)有l(wèi)uxF基因，它通常位于luxB和luxE之間，其編碼的蛋白質(zhì)分子量為26 kD 左右，但lux F基因在弧菌屬和異短桿菌屬中的發(fā)光基因系統(tǒng)中尚未被發(fā)現(xiàn)。在以上所有菌株的操縱子中，這些基因的順序都相同，均為lux CDAB(F)E。

在lux 系統(tǒng)中，結(jié)構基因上游有2個調(diào)節(jié)基因，它們是lux I和luxR。它們分別屬于兩個不同的操縱子之中，lux I在右面的操縱子中，右面的操縱子中還含有l(wèi)ux CDAB(F)E基因，lux I位于lux C 的上游。lux 系統(tǒng)的整個結(jié)構如下：luxR，lux DAB(F)E。lux I編碼的是發(fā)光細菌自誘導物（autoinducer）因子合成酶，luxR 編碼的是發(fā)光系統(tǒng)的調(diào)節(jié)蛋白。研究表明，luxI和luxR基因的表達產(chǎn)物都是lux 系統(tǒng)完整表達并產(chǎn)生發(fā)光的調(diào)節(jié)物質(zhì)，任何一個基因的有效突變都會改變lux系統(tǒng)的表達水平，甚至使發(fā)光細菌變?yōu)榘底兎N。

五、發(fā)光基因特性

發(fā)光細菌所含的發(fā)光基因（lux gene）表達的直接結(jié)果是產(chǎn)生生物發(fā)光，非常直觀而且易于檢測，因而被廣泛應用于基因操作，作為標記（marker）基因和報告（reporter）基因來研究基因的轉(zhuǎn)導、表達和調(diào)控。另外，通過基因工程而產(chǎn)生的很多基因工程發(fā)光細菌的研究和應用也很有價值。完整的發(fā)光基因系統(tǒng)已經(jīng)被成功地轉(zhuǎn)入其他細胞中，如原核細胞、真核細胞和哺乳動物細胞。lux基因可以作為一個很好的標記基因重組在質(zhì)粒載體或其他載體上。若將發(fā)光基因系統(tǒng)中的結(jié)構基因放在一個被試的啟動子的下游，一并插入載體DNA中進行轉(zhuǎn)導實驗，可通過宿主細胞是否發(fā)光確定轉(zhuǎn)導是否成功，并通過宿主細胞的發(fā)光強度的高低來確定發(fā)光基因的轉(zhuǎn)錄表達水平和結(jié)構基因上游的啟動子的活性大小。另外，還可以用發(fā)光基因來研究終止子（terminator）的活性大小，以及研究其他細胞內(nèi)的某些基因的表達與調(diào)控的規(guī)律。利用含有l(wèi)ux系統(tǒng)的具有感染力的載體（噬菌體）在感染宿主細胞時能產(chǎn)生生物發(fā)光的現(xiàn)象，可以研究其感染的過程和機理。

六、具體應用

基因工程發(fā)光細菌是指通過基因工程技術將lux系統(tǒng)導入其他非發(fā)光宿主細胞后，形成一類能夠發(fā)光的細菌。利用基因工程發(fā)光細菌可以快速測定化學物質(zhì)及環(huán)境污染物的毒性，確定生物的存活能力，快速確定環(huán)境污染的程度以及進行環(huán)境質(zhì)量的評價。還可以利用基因工程發(fā)光細菌進行細菌在土壤和水體中分布的研究等。

lux 基因作為報告基因，用其構建基因工程微生物，通過對光線的檢測可以對微生物在環(huán)境中的生長、分布、活性等進行實時在線監(jiān)測。如利用發(fā)光酶基因標記的熒光假單胞菌檢測在小麥根圈的定植動態(tài)；跟蹤棉花根圈中的綠針假單胞菌；用發(fā)光酶基因標記巨大芽孢桿菌，獲得穩(wěn)定發(fā)光的標記菌株，用于研究其在小麥根際的定殖動態(tài)和散布規(guī)律等。

某些細菌長期生活在含有某種化學物質(zhì)的環(huán)境中，細菌基因組中含有對該物質(zhì)具有特異性的誘導基因和降解基因，或具有對該物質(zhì)的抗性基因。將這些基因與lux基因融合構成重組體，在特異的化學物質(zhì)存在時產(chǎn)生誘導作用，啟動誘導基因并導致lux基因表達，而由重組體的發(fā)光與否就可得知某化學物質(zhì)是否存在。研究者們利用細菌對汞的抗性是依賴于Hg 與merR（汞抗性基因的調(diào)節(jié)基因）基因產(chǎn)物的結(jié)合和表達激活的原理，構建了由merR基因和luxAB基因融合的質(zhì)粒載體，建立了發(fā)光強度與汞含量的關系。該系統(tǒng)靈敏度高而且專一性很強，用這種方法可檢測出環(huán)境中納克級的汞。因此，利用這種物質(zhì)依賴性的基因工程發(fā)光細菌在這種特異性物質(zhì)的存在條件下高水平的表達出生物發(fā)光，且發(fā)光強度與該物質(zhì)的劑量呈正相關的特點，可以檢測環(huán)境中該物質(zhì)的存在量。已經(jīng)構建了汞、砷、苯、萘等物質(zhì)依賴性的基因工程發(fā)光菌，用于環(huán)境中此類物質(zhì)的檢測。發(fā)光細菌經(jīng)過各種理化方法誘變處理后失去發(fā)光的能力，成為暗變異株。在接觸致突變物后，暗變異株可恢復一定的發(fā)光能力（通?？墒拱底儺愔甑陌l(fā)光強度增加1000倍左右）。利用暗變異株恢復發(fā)光的現(xiàn)象，可對各種遺傳毒物進行篩選、檢測。此法與其他微生物學方法（如Ames試驗）相比有靈敏、簡便、快速、無需嚴格無菌操作等特點。已開發(fā)了“Mutatox”的檢測系統(tǒng)，這是繼發(fā)光細菌急性毒性檢測的“microtox”之后推出的又一項發(fā)光細菌檢測技術。

另外，將lux系統(tǒng)導人某種噬菌體的DNA中，利用噬菌體與其宿主菌之間嚴格的特異性，可以檢測宿主菌的分布、數(shù)量以及活性，靈敏度高而且速度很快，為環(huán)境微生物檢測提供了一種靈敏有效的方法。

七、方法介紹

水污染問題日益嚴重，與此同時也開發(fā)出許多靈敏、有效的環(huán)境監(jiān)測方法，這些方法可以劃分為兩類：分析技術和生物監(jiān)測。其中分析技術常常用于廢水常規(guī)指標的測試，但不能反應水質(zhì)綜合毒性的大小。傳統(tǒng)的生物監(jiān)測以水蚤、藻類或魚類為受試對象，雖然能反映毒物對生物的直接影響，但是這些方法的缺點是實驗周期長，實驗過程比較繁瑣。針對傳統(tǒng)生物毒性檢測方法的不足，研究和開發(fā)新型生物毒性監(jiān)測技術——發(fā)光細菌法。該方法以簡便的操作方式、測量結(jié)果一目了然，受到了科研單位和企業(yè)的青睞。

自1672年R．Boyle觀察到發(fā)光的菌體所發(fā)出的光易被化學物質(zhì)抑制后，許多科學家相繼對細菌的發(fā)光效應進行了大量的研究。本世紀70年代至80年代初，國外科學家從海魚體表分離和篩選出對人體無害，對環(huán)境敏感的發(fā)光細菌，用于檢測水體生物毒性，現(xiàn)已成為一種簡單、快速的生物毒性檢測手段。80年代初我國引進了這項技術，并先后分離出海水型和淡水型（青?；【┑陌l(fā)光細菌，用以檢測環(huán)境污染物的急性生物毒性。

一般發(fā)光細菌長約1.5-3um（微米），寬度0.5-0.8um，因此肉眼根本看不到，要用顯微鏡放大至1千倍時方可以分辨它們的體形。而它們的發(fā)光，也要在特定的條件中才能看得見。青海弧菌是的非致病型淡水發(fā)光菌，所以產(chǎn)品青海弧菌凍干粉在運輸、使用過程中安全可靠，對廢棄的菌液也不用進行特殊處理，不會引起二次污染。

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