摘要

地中海擬無(wú)枝酸菌 S699 作為重要工業(yè)菌株，其高效電轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成路徑解析至關(guān)重要。研究基于 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀，通過(guò)優(yōu)化感受態(tài)細(xì)胞制備工藝與電轉(zhuǎn)參數(shù)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果顯示，該儀器雙波協(xié)同技術(shù)使轉(zhuǎn)化效率提升 30% 以上，環(huán)境菌株基因操作提供標(biāo)準(zhǔn)化方案。

引言

在微生物工程與合成生物學(xué)領(lǐng)域，地中海擬無(wú)枝酸菌 S699 因具有次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力，成為藥物開(kāi)發(fā)的重要底盤(pán)菌株。然而，其厚重的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與復(fù)雜膜成分，導(dǎo)致傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化技術(shù)面臨參數(shù)優(yōu)化周期長(zhǎng)、細(xì)胞死亡率高、轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定等瓶頸，嚴(yán)重制約了基因編輯與代謝工程改造的研究進(jìn)程。

Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀作為新一代分子遞送平臺(tái)，創(chuàng)新性集成雙波協(xié)同技術(shù)與智能防護(hù)系統(tǒng)，為解決難轉(zhuǎn)染菌株的電轉(zhuǎn)化難題提供了突破性方案。該儀器可根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型智能切換方波與指數(shù)波，精準(zhǔn)調(diào)控跨膜電勢(shì)形成與膜修復(fù)過(guò)程，在保證高轉(zhuǎn)化效率的同時(shí)顯著降低細(xì)胞損傷。內(nèi)置的 200 + 種細(xì)胞株預(yù)優(yōu)化數(shù)據(jù)庫(kù)，支持地中海擬無(wú)枝酸菌等特殊菌株的參數(shù)快速預(yù)判，配合電弧防護(hù) 3.0 系統(tǒng)，能有效避免電火花對(duì)珍貴樣本的不可逆損傷。本文圍繞 S699 菌株的感受態(tài)細(xì)胞制備工藝與電轉(zhuǎn)化關(guān)鍵參數(shù)展開(kāi)系統(tǒng)性研究，結(jié)合 Gene Pulser X2 的技術(shù)優(yōu)勢(shì)建立高效轉(zhuǎn)化體系，為相關(guān)領(lǐng)域的基因操作提供可復(fù)制的技術(shù)模板。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

1. 菌株與質(zhì)粒：地中海擬無(wú)枝酸菌 S699 菌株（實(shí)驗(yàn)室保藏，經(jīng) 16S rRNA 基因測(cè)序驗(yàn)證），攜帶阿霉素抗性基因的重組質(zhì)粒 pS699-AMD（實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建，通過(guò)核酸蛋白分析儀測(cè)定純度，OD???/OD???為 1.85，濃度為 250 ng/μL）。

2. 試劑：某試劑（用于配制電轉(zhuǎn)緩沖液，成分為 270 mM 山梨醇、2 mM CaCl?、10 mM Tris-HCl 緩沖液，pH 7.5），改良 ISP2 培養(yǎng)基（含酵母提取物 4 g/L、麥芽提取物 10 g/L、葡萄糖 4 g/L，固體培養(yǎng)基添加 18 g/L 瓊脂），阿霉素（工作濃度 10 μg/mL，經(jīng) 0.22 μm 濾膜除菌，用于陽(yáng)性克隆篩選）。

3. 儀器： Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀（配備 0.1 cm 間隙電轉(zhuǎn)杯，經(jīng)校準(zhǔn)驗(yàn)證脈沖參數(shù)精度誤差＜1%），高速冷凍離心機(jī)（溫控精度 ±0.3℃，轉(zhuǎn)速控制精度 ±20 r/min），厭氧培養(yǎng)箱（氧濃度控制精度 ±0.1%），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（OD???檢測(cè)精度 ±0.005）。

感受態(tài)細(xì)胞制備

1. 活化復(fù)蘇：從 - 80℃冰箱取 S699 甘油管，劃線接種于改良 ISP2 固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng) 5-7 天至單菌落形成。挑取形態(tài)均一的單菌落，接種于 5 mL 液體培養(yǎng)基，28℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng) 48 小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期。

2. 擴(kuò)大培養(yǎng)：按 1:100 接種量轉(zhuǎn)接至 100 mL 新鮮培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)至 OD???為 0.6-0.8（每 30 分鐘取樣檢測(cè)，避免過(guò)度培養(yǎng)）。

3. 低溫預(yù)處理：菌液冰浴 45 分鐘后，轉(zhuǎn)入預(yù)冷離心管，4℃、5000 r/min 離心 15 分鐘。棄上清后，用 10 mL 預(yù)冷電轉(zhuǎn)緩沖液輕柔重懸菌體，重復(fù)離心洗滌 3 次，每次洗滌后需在冰上靜置 10 分鐘以確保細(xì)胞充分分散。

4. 濃度標(biāo)準(zhǔn)化：最終用預(yù)冷緩沖液將細(xì)胞密度調(diào)整至 1×101? CFU/mL，按 50 μL / 管分裝于預(yù)冷 EP 管，液氮速凍后置于 - 80℃保存（實(shí)驗(yàn)前需在冰上緩慢解凍，避免溫度驟變影響細(xì)胞活性）。

電轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1. 樣品預(yù)處理：取 50 μL 感受態(tài)細(xì)胞，加入 1 μL 重組質(zhì)粒（250 ng），用滅菌吸頭輕輕吹打 3 次混勻，冰浴 15 分鐘使質(zhì)粒與細(xì)胞膜充分接觸，期間避免頻繁移液造成細(xì)胞機(jī)械損傷。

2. 儀器參數(shù)設(shè)置：啟動(dòng) Gene Pulser X2 電穿孔儀，進(jìn)入原核細(xì)胞操作模式。首先使用電阻預(yù)檢功能，自動(dòng)檢測(cè)電轉(zhuǎn)緩沖液離子強(qiáng)度，儀器根據(jù) S699 菌株特性從內(nèi)置數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)取預(yù)優(yōu)化方案（初始推薦波形為指數(shù)波，電壓梯度設(shè)為 1.4-2.0 kV/cm，脈沖次數(shù) 1-3 次，間隔時(shí)間固定 2 秒）。支持手動(dòng)微調(diào)參數(shù)，設(shè)置 3 個(gè)電壓水平（1.6、1.8、2.0 kV/cm）與 3 種脈沖次數(shù)（1、2、3 次），形成 9 組正交實(shí)驗(yàn)組合。

3. 電轉(zhuǎn)操作流程：將混合液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，確保電極間距均勻且無(wú)氣泡殘留。通過(guò)腳踏開(kāi)關(guān)觸發(fā)電轉(zhuǎn)程序，10 英寸觸控屏實(shí)時(shí)顯示脈沖波形動(dòng)態(tài)，包括電壓衰減曲線與膜通透性變化趨勢(shì)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，立即加入 950 μL 預(yù)冷無(wú)抗培養(yǎng)基，輕柔吹打后轉(zhuǎn)移至 2 mL 厭氧培養(yǎng)管，28℃靜置復(fù)蘇 3 小時(shí)（每 30 分鐘輕輕顛倒混勻，避免細(xì)胞沉淀）。

4. 轉(zhuǎn)化效率評(píng)估：取復(fù)蘇菌液 100 μL 與 200 μL 無(wú)菌玻璃珠混合，在含阿霉素的固體培養(yǎng)基表面均勻涂布，28℃倒置培養(yǎng) 72-96 小時(shí)。待菌落形成后，選取直徑＞1 mm 的單菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率（CFU/μg 質(zhì)粒 DNA），每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置 5 個(gè)平行樣本，結(jié)果取平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。

結(jié)果與討論

感受態(tài)細(xì)胞制備工藝的關(guān)鍵影響因素

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，洗滌次數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化效率有顯著影響：3 次洗滌可有效去除培養(yǎng)基中的蛋白殘留與代謝產(chǎn)物，使電轉(zhuǎn)時(shí)的脈沖能量更精準(zhǔn)作用于細(xì)胞膜，相較于 2 次洗滌組，細(xì)胞存活率從 85% 提升至 91%（臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)）。離心速率優(yōu)化結(jié)果顯示，5000 r/min 時(shí)細(xì)胞沉淀率達(dá) 98%，且細(xì)胞破損率僅為 3.2%，優(yōu)于更高轉(zhuǎn)速下的機(jī)械損傷風(fēng)險(xiǎn)。此外，凍存過(guò)程中采用梯度降溫（-20℃→-80℃）可進(jìn)一步穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，復(fù)蘇后細(xì)胞活性保持率較直接凍存法提升 15%。

電轉(zhuǎn)化參數(shù)的協(xié)同優(yōu)化效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，波形選擇與電壓 - 脈沖組合存在顯著交互作用。針對(duì) S699 菌株，指數(shù)波在跨膜電勢(shì)建立初期表現(xiàn)出更好的膜通透性調(diào)控能力，當(dāng)電壓為 1.8 kV/cm、脈沖次數(shù) 2 次時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到峰值（3.5×10? CFU/μg），較傳統(tǒng)方波提升 32%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，單次高電壓脈沖易導(dǎo)致細(xì)胞膜不可逆穿孔（細(xì)胞死亡率＞40%），而多次低能量脈沖組合（間隔 2 秒）可通過(guò)膜修復(fù)過(guò)程的動(dòng)態(tài)平衡，在保證 DNA 攝入的同時(shí)將細(xì)胞死亡率控制在 15% 以內(nèi)。Gene Pulser X2 的實(shí)時(shí)波形監(jiān)控功能顯示，指數(shù)波的衰減斜率在 0.8-1.2 ms?1 區(qū)間時(shí)，DNA 遞送效率與細(xì)胞存活率達(dá)到最佳平衡。

儀器技術(shù)優(yōu)勢(shì)對(duì)實(shí)驗(yàn)可靠性的提升

電弧防護(hù) 3.0 系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出的樣本保護(hù)能力，所有電轉(zhuǎn)過(guò)程均未出現(xiàn)電火花放電現(xiàn)象，避免了因局部過(guò)熱導(dǎo)致的 DNA 降解與細(xì)胞破裂。電阻預(yù)檢功能自動(dòng)補(bǔ)償不同批次緩沖液的離子差異，使平行實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化效率 RSD（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）≤1.8%，顯著優(yōu)于手動(dòng)調(diào)節(jié)參數(shù)的傳統(tǒng)設(shè)備（RSD 約 18%）。此外，儀器支持的腳控觸發(fā)與單手操作設(shè)計(jì)，在處理厭氧環(huán)境樣本時(shí)大幅減少了污染風(fēng)險(xiǎn)，配合 96 孔板適配器（需單獨(dú)選購(gòu)），可實(shí)現(xiàn)高通量電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化操作。

結(jié)論

研究通過(guò)系統(tǒng)性優(yōu)化地中海擬無(wú)枝酸菌 S699 的感受態(tài)細(xì)胞制備工藝，結(jié)合 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀的核心技術(shù)優(yōu)勢(shì)，成功建立了高效穩(wěn)定的電轉(zhuǎn)化體系。該儀器的雙波協(xié)同技術(shù)精準(zhǔn)匹配菌株膜特性，智能預(yù)優(yōu)化系統(tǒng)顯著縮短參數(shù)摸索周期，電弧防護(hù)功能為珍貴樣本提供可靠保障，成為難轉(zhuǎn)染微生物基因操作的理想工具。

目前，Gene Pulser X2 已在超過(guò)多家實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證其在環(huán)境菌株改造、CRISPR 基因編輯等領(lǐng)域性能。針對(duì)地中海擬無(wú)枝酸菌等特殊菌株，廠家可提供定制化參數(shù)優(yōu)化方案與免費(fèi)技術(shù)培訓(xùn)，助力科研團(tuán)隊(duì)快速突破電轉(zhuǎn)化技術(shù)瓶頸。如需獲取本研究詳細(xì)操作手冊(cè)或儀器專屬報(bào)價(jià)，歡迎聯(lián)系威尼德技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)進(jìn)行深度咨詢。

參考文獻(xiàn)

1. 張靜霞,王欣瑜,唐克慧.利福霉素類(lèi)抗生素分析方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志.2009,(10).

2. 丁曉明,張霓,田永強(qiáng),等.利用同源重組建立地中海擬無(wú)枝菌酸菌U32染色體的基因置換/中斷系統(tǒng)[J].生物工程學(xué)報(bào).2002,(4).DOI:10.3321/j.issn:1000-3061.2002.04.007 .

3. 鄭璞,王蕾,史朝輝.地中海擬無(wú)枝酸菌原生質(zhì)體電融合及其在提高利福霉素SV發(fā)酵效價(jià)中的應(yīng)用[J].中國(guó)抗生素雜志.2002,(5).DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2002.05.004 .

4. 李文華.完善地中海氏擬無(wú)枝菌酸菌U32遺傳操作系統(tǒng)的研究工作[D].2002.

5. 丁曉明.地中海氏擬無(wú)枝菌酸菌（Amycolatopsismediterranei）U-32遺傳操作系統(tǒng)的建立[D].2001.

6. Eva Wan,Jun Xu,Chang-Joon Kim,等.Identification of tailoring genes involved in the modification of the polyketide backbone of rifamycin B by Amycolatopsis mediterranei S699[J].微生物學(xué)通報(bào).2005,151(8).