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鈣信號(hào)研究：常見鈣離子檢測工具及其應(yīng)用_MedChemExpress(MCE 中國)
鈣離子（Ca2+）作為生物體內(nèi)重要的第二信使，在眾多生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。從神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)到肌肉的收縮，從細(xì)胞的增殖與分化到激素的分泌，鈣離子都扮演著重要的角色。
Section.01
細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測方法
準(zhǔn)確地檢測和分析細(xì)胞內(nèi)或組織中的鈣離子濃度變化，對于深入理解各種生理和病理過程具有極其重要的意義[1]。細(xì)胞內(nèi)鈣離子的常見檢測方法主要有鈣離子選擇性微電極測定法、同位素示蹤法、核磁共振法、熒光探針法等。
鈣離子選擇性微電極測定法在檢測過程中不需要使用指示劑，但在穿刺細(xì)胞時(shí)可能會(huì)造成損傷，進(jìn)而引發(fā)滲漏問題。同位素示蹤法雖然具有較高的靈敏度，卻對靜息狀態(tài)下的 Ca2+ 水平不敏感，并且存在一定的放射性影響。核磁共振法雖能在接近生理狀態(tài)下檢測 Ca2+ 的變化，但其成本較高。相比之下，熒光探針法目前是檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子分布及變化情況的廣泛應(yīng)用的方法。
Section.02
常見的鈣離子探針
自上個(gè)世紀(jì) Roger Tsien 團(tuán)隊(duì)開發(fā)出第一款鈣離子熒光探針以來[2]，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，市場上出現(xiàn)了眾多種類的鈣離子探針，目前已有許多商業(yè)化的鈣離子探針。其中，常用的鈣離子探針包括 Fluo-4 AM、Fluo-3 AM、Rhod-2 AM 和 Fura-2 AM 等。接下來，讓我們逐一探討這些鈣離子探針的具體應(yīng)用。
常用的 Ca2+ 熒光探針根據(jù)波長的不同，分為可見光激發(fā) Ca2+ 熒光探針和紫外光激發(fā) Ca2+ 熒光探針兩大類。
與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，可見光激發(fā) Ca2+ 探針具有以下特點(diǎn)：
1）適用于大多數(shù)的激光共聚焦測鈣系統(tǒng)，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細(xì)胞儀等。
2）具有更強(qiáng)的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測 Ca2+ 變化，從而降低了對活細(xì)胞的光毒性。
3）Ca2+ 依賴性熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，對 Ca2+ 變化水平檢測敏感度更高。
4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。
5）兼容光激活探針以及 UV- 激發(fā)試劑，因此更方便于多參數(shù)檢測。
6）無光譜偏移。
Fluo-3, AM
Fluo-3, AM (HY-D0716) 是一種常用的檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針。它穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成 Fluo-3，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo-3 游離配體幾乎是非熒光性的，但與鈣離子結(jié)合后熒光顯著增強(qiáng)，熒光增加可達(dá) 60 至 80 倍。激發(fā)波長為 506 nm，發(fā)射波長為 526 nm。實(shí)際檢測時(shí)推薦使用的激發(fā)波長為 488 nm 左右，發(fā)射波長為 525～530 nm。
MBP 處理降低了 Ca2+ 信號(hào)傳導(dǎo)，此現(xiàn)象可以被 XBP1 敲低逆轉(zhuǎn)。
圖 1. 使用 Fluo-3AM 染料測量神經(jīng)元 Ca2+ 信號(hào)[3]。
EtOH ：溶劑對照；MBP：鄰苯二甲酸單丁酯。
Fluo-4, AM
Fluo-4 AM (HY-101896) 是 Fluo-3, AM 的升級(jí)版，熒光比 Fluo-3 更亮。Fluo-4, AM 分子上的兩個(gè)氯原子被氟取代，這種結(jié)構(gòu)上的微小變化其可以加載更快并且在相同條件下熒光更加明亮。它同樣可以穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)被酯酶剪切形成 Fluo-4。Fluo-4 的激發(fā)波長為 494 nm，發(fā)射波長為 516 nm。Fluo-4, AM 適用于熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀等檢測手段。
檢測發(fā)現(xiàn)，US + MBs 處理使永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (HCMEC/D3) 細(xì)胞質(zhì)中的 Ca2+ 水平上升，同時(shí)這種現(xiàn)象可以被抗壞血酸拮抗。
圖 2. 通過 Fluo-4, AM 熒光探針檢測細(xì)胞中的 Ca2+ 信號(hào)[4]。
US + MBs:超聲和微泡處理；AA：抗壞血酸
Rhod-2 AM
Rhod-2 AM (HY-D0989), 羅丹明 123 (Rhodamine 123, Rh-123) 的行生產(chǎn)物，是一種高親和力的可見光激發(fā)波長 Ca2+ 熒光探針，波長明顯長于 Fluo-3 或 Fluo-4，其與 Ca2+ 結(jié)合后的大激發(fā)波長為 550 nm，發(fā)射波長為 578 nm，此探針更適用于具有高水平自熒光信號(hào)的細(xì)胞或組織 Ca2+ 水平檢測，也可用來檢測由光感受器和籠鎖鈣離子螯合劑光激活導(dǎo)致的鈣離子釋放。同時(shí)由于其正電荷特性，會(huì)特異性聚集在線粒體里，由此可以與 Rhodamine 123 聯(lián)合使用用于測定線粒體內(nèi)鈣離子水平。
Rh-123 的綠色熒光表示線粒體正常，其強(qiáng)度隨膜損傷而降低，而 Rhod-2 AM 的紅色熒光表示線粒體 Ca2+ 水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng) F/G/H-GNC 處理的細(xì)胞熒光從綠色變?yōu)榧t色，表明線粒體完整性受損，鈣穩(wěn)態(tài)被破壞。
Mag-Fluo-4 AM
Mag-Fluo-4 AM (HY-D1498) 是一種 Fluo-4 的類似物，具有特別的鈣和鎂離子檢測特性。它對 Mg2+ 的結(jié)合親和力（Kd）為 4.7 mM，而對 Ca2+ 的 Kd 為 22 µM，因此可以用作細(xì)胞內(nèi)鎂離子的指示劑以及低親和力的鈣離子指示劑。
Mag-Fluo-4 AM 染料能夠特異性地被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)捕獲，因此非常適合檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)游離鈣離子濃度的變化。在熒光酶標(biāo)儀下，Mag-Fluo-4 AM 的激發(fā)波長為 490 nm，發(fā)射波長為 525 nm。
Fura-2 AM 和 Indo-1 AM 均屬于可見光激發(fā)的鈣離子熒光指示劑，是目前常用的比率測量熒光探針。
1）與第一代染料 Quin-2 相比，F(xiàn)ura-2 和 Indo-1 具有更強(qiáng)的熒光發(fā)射，并且在生理 pH 范圍內(nèi)對 pH 變化不敏感。這一特性使得它們在多種實(shí)驗(yàn)條件下仍能保持穩(wěn)定的讀數(shù)。
2）Fura-2 和 Indo-1 對鈣離子 (Ca2+) 具有更高的選擇性，相比于二價(jià)金屬離子如鎂 (Mg2+)、鋅 (Zn2+)、錳 (Mn2+)、鐵 (Fe2+) 等，它們對 Ca2+ 的親和力更強(qiáng)。
3）作為雙波長熒光染料，F(xiàn)ura-2 和 Indo-1 在標(biāo)定 Ca2+ 濃度時(shí)并不僅僅依賴于熒光強(qiáng)度的變化，而是通過比較不同波長下的熒光比率來實(shí)現(xiàn)。這一比率測量的方法大大提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。
Fura-2 AM
Fura-2 AM (HY-101897) 是紫外光激發(fā)的比值型或雙波長熒光染料，其激發(fā)特性與 Ca2+ 濃度有關(guān)，當(dāng)介質(zhì)中沒有 Ca2+ 時(shí)，其激發(fā)峰為 380 nm，當(dāng)與鈣結(jié)合時(shí)，激發(fā)峰向短波方向 340 nm 處移動(dòng)，最后分別以 340 nm、380 nm 激發(fā)得到發(fā)射光的比例，這種比例與細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 濃度成正比例的關(guān)系。發(fā)射光譜在 530 nm 處測量[6]。
比率型熒光探針減少了染料負(fù)載導(dǎo)致的指示不均勻、不良的染料保留和光漂白的影響。另外 Fura-2 還具有較強(qiáng)的抗熒光淬滅能力，在熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備上可以連續(xù)檢測較長時(shí)間，也不會(huì)明顯影響其熒光效果。
圖 4. 發(fā)射光譜在 530 nm 處測量不同鈣離子濃度時(shí) Fura-2 的激發(fā)光譜的情況[6]。
Section.03
實(shí)驗(yàn)小貼士
以 Fluo-4 或 Fluo-4 AM 為例，常規(guī)的熒光探針如 Fluo-4 本身是一種極性較大的酸性化合物，無法直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。如果需要進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，通常需要借助膜片微電極 (patch pipette)、顯微注射 (microinjection) 或胞引作用等方法來輔助藥物的加載，這些過程往往繁瑣且復(fù)雜。
為了解決這一問題，F(xiàn)luo-4 的負(fù)性基團(tuán)上結(jié)合了乙酰氧甲酯 (AM)。這一簡單的化學(xué)改造不僅提高了其脂溶性，還消除了負(fù)電荷，從而顯著增強(qiáng)了其細(xì)胞滲透性。研究者只需將細(xì)胞孵育在含有 Fluo-4 AM 的培養(yǎng)液中，就可以輕松實(shí)現(xiàn)探針的加載，省去了許多麻煩的步驟。
一旦 Fluo-4 AM 進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酯酶會(huì)對其進(jìn)行水解，恢復(fù)為 Fluo-4 形式，使其能夠在細(xì)胞內(nèi)正常發(fā)揮生理功能。通過這種方法，熒光探針的應(yīng)用變得更為簡便與高效。
丙磺舒 (Probenecid) 是一種細(xì)胞膜中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑。當(dāng)帶有AM基團(tuán)的鈣離子熒光探針進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成帶負(fù)電荷的形式，準(zhǔn)備與鈣離子結(jié)合。然而，一些細(xì)胞系中存在陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些蛋白會(huì)將已經(jīng)轉(zhuǎn)化為負(fù)電荷形式的鈣離子熒光探針運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜外。當(dāng)加入丙磺舒后，它會(huì)抑制這些陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，從而防止探針的外泄，使得探針能夠在細(xì)胞內(nèi)充分發(fā)揮作用達(dá)到好的效能。
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鈣離子探針可以用于植物，在植物中比較常用的是 Fluo-4[7][8]。具體的方案方法可以參考文獻(xiàn)。
此外，熒光染料在保存、實(shí)驗(yàn)的過程中需要注意避光操作。配制好的染色工作液必須一次使用完畢，不能凍存喔~
好啦！本期分享就到這里，有需要的小伙伴自行點(diǎn)贊收藏~
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[1] Eisner D, et al. Physiology of intracellular calcium buffering [published correction appears in Physiol Rev. 2024 Jan 1;104(1):327.
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