目前，鐵死亡的標(biāo)志物主要分為三類：細胞形態(tài)，分子水平和代謝水平。

脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的核心驅(qū)動因素，過度的脂質(zhì)過氧化通過產(chǎn)生有毒的磷脂氫過氧化物 (PLOOH)，在促進鐵死亡中起著重要作用，因此過氧化脂質(zhì)可用于細胞鐵死亡的檢測。

在對骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細胞鐵死亡的研究中，為了證實 SM@ApoFn nanocage 具有抑制細胞鐵死亡的功能，作者用脂溶性比率型熒光探針 BODIPY 581/591 C11 來評估細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平。如圖所示，BODIPY 581/591 C11 (10 μM) 探針分析 IL-1β 預(yù)處理 12 小時后，各組給予 SM04690、ApoFn 和 SM@ApoFn 處理 24 h 的軟骨細胞中細胞膜脂質(zhì)的氧化和還原狀態(tài)，其中 SM@ApoFn 減輕 IL-1β 引起的脂質(zhì)過氧化。

圖 1. SM@ApoFn 減輕 IL-1β 引起的脂質(zhì)過氧化^[1]。 

BODIPY 581/591 C11 (10 μM) 探針分析 IL-1β 預(yù)處理 12 小時后，各組給予 SM04690/ApoFn 和 SM@ApoFn 處理 24 h 的軟骨細胞中細胞膜脂質(zhì)的氧化和還原狀態(tài)。

活性氧 (ROS) 在鐵死亡過程中不僅促進脂質(zhì)過氧化和細胞損傷，還抑制抗氧化信號通路，是鐵死亡 檢 測 的 重 要 生 物 標(biāo) 志 物。

在研究不同谷胱甘肽過氧化物酶 4 (GPX4) 抑制劑的納米藥物開發(fā)中，用 DCFH-DA 熒光探針檢測不同納米藥物處理的 HT-1080 細胞中總的 ROS 水平。其中納米藥物 2b 對 GPX4 有較好的抑制效果，導(dǎo)致細胞內(nèi)的 ROS 水平顯著升高。

圖 2. 不同納米藥物處理的 HT-1080 細胞中的總 ROS 水平檢測^[2]。 

用 C11-BODIPY 和 DCFH-DA 熒光探針檢測不同納米藥物處理的 HT-1080 細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化和總 ROS。

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中，大量的脂質(zhì)過氧化初級產(chǎn)物在氧化反應(yīng)中逐漸分解為一系列復(fù)雜的醛類化合物，包括 MDA，4-HNE，丙醛和己醛等。這些活性醛類物質(zhì)能夠攻擊蛋白質(zhì)等生物大分子，形成加合物，從而引發(fā)細胞的進一步損傷。

在研究真核翻譯起始因子 EIF4E 通過控制脂質(zhì)過氧化作為鐵死亡敏感性的決定因素的研究中。科研人員為了研究 4HNE 產(chǎn)量增加是否會影響反饋回路，從而降低細胞對鐵死亡的敏感性。結(jié)果表明，用 RSL3 處理后，ALDH1B1 的過表達限制了 WT 和 EIF4E 過表達的 Calu-1 細胞中 4HNE 的積累，這表明 ALDH1B1 在限制鐵死亡期間細胞中 4HNE 的產(chǎn)生方面仍然發(fā)揮著重要作用。

需要注意的是，MDA 和 4-HNE 在除鐵死亡外的多種氧化 應(yīng)激狀態(tài)下均可產(chǎn)生，在實際應(yīng)用中，一般與其他檢測方法進行相互驗證，以提高結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

圖 3. 用 RSL3（0.5 μM，4 小時）處理不同過表達體系的 Calu-1 細胞中 4HNE 染色的免疫熒光分析^[3]。

鐵死亡過程中，細胞內(nèi)亞鐵離子的積累會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加，促進脂質(zhì)過氧化。因此，細胞鐵含量或者 Fe²⁺/Fe³⁺ 比值的測定可作為鐵死亡監(jiān)測的重要指標(biāo)。FerroOrange 是一種特異性 Fe²⁺ 探針，與 Fe²⁺ 結(jié)合形成橙色熒光復(fù)合物，可通過熒光顯微鏡或流式細胞術(shù)檢測 (Ex/Em: 542/572 nm), 從而定量分析細胞內(nèi) Fe²⁺ 的濃度。

研究人員在明確 PGS（一種天然產(chǎn)物 P-L）對腎臟、智力及神經(jīng)保護的潛在作用，探索 PGS 的確切靶點及作用機制。在研究 PGS 是否減輕缺氧 BV2 細胞脂質(zhì)過氧化物積累引起的鐵死亡實驗中，使用 FerroOrange 染色，PGS 可減輕 BV2 細胞中缺氧 (HH) 誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖 4. PGS (一種天然產(chǎn)物 P-L, 50 μg/mL; P-M, 100 μg/mL; P-H, 200 μg/mL) 可減輕 BV2 細胞中缺氧 (HH) 誘導(dǎo)的鐵死亡^[4]。

谷胱甘肽 (GSH) 是細胞內(nèi)主要的抗氧化劑，在鐵死亡過程中，GSH 水平顯著下降，導(dǎo)致抗氧化能力減弱， 進而促進脂質(zhì)過氧化物的積累。因此，檢測 GSH 相關(guān)代謝等指標(biāo)可用于監(jiān)測鐵死亡的過程。

鐵死亡在腸缺血再灌注損傷中起著至關(guān)重要的作用，抑制鐵死亡可能為治療該疾病提供新的途徑，研究人員在對鐵死亡發(fā)生的小鼠腸道缺血再灌注模型中進行檢測，再灌注 30 min 后，組織中總鐵和 Fe²⁺ 含量最高，LPO 產(chǎn)物 MDA 也隨再灌注時間延長而積累，還原型 GSH 水平降低，氧化型 GSSG 水平升高。

圖 5. 小鼠腸道缺血再灌注模型中，再灌注 30 min 后使用 GSH?+?GSSG/GSH 檢測試劑盒評估腸道組織中谷胱甘肽、GSH、GSSG 和 GSH/GSSG 水平^[5]。

鐵死亡細胞的典型形態(tài)學(xué)特征包括質(zhì)膜完整性喪失，細胞膜破裂，線粒體，線粒體外膜破裂、嵴減少或缺失、膜密度增加，可通過透射電子顯微鏡 (TEM) 檢測。此外，鐵死亡發(fā)生時，也伴隨著線粒體膜通透性增加和線粒體膜電位降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)粘度增加和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激， 以及溶酶體鐵或一氧化氮 (NO) 的累積?？山柚嚓P(guān)熒光探針，用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

在研究溴結(jié)構(gòu)域蛋白 4（BRD4）抑制 Erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡中，研究人員使測量了 BRD4 抑制前后細胞的氧化分解代謝，與 Erastin 處理組相比，當(dāng) BRD4 被其抑制劑 (+)-JQ1 和 PFI-1 抑制時，檢測到的線粒體膜電位低得多。

圖 6. Erastin (10 μM, 24 h) 誘導(dǎo) HT1080 鐵死亡，JC-1 檢測線粒體膜電位變化^[6]。 

鐵死亡主要由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化引起，其調(diào)控機制包括多種，主要分為過氧化代謝部分 (如鐵代謝和脂代謝途徑) 和抗氧化部分 (如 System xc^--GSH-GPX4 途徑，AIFM2-CoQ10/GCH1-BH4/ ESCRT-III 和 DHODH 途徑)。鐵死亡發(fā)生時，一些關(guān)鍵基因和蛋白表達水平發(fā)生變化，因此，采用 Western blot / 免疫熒光 / 免疫組織化學(xué) / 實時熒光定量 PCR 技術(shù)等方法來表征鐵死亡的發(fā)生。

在探討鐵死亡是否參與缺氧缺血性腦損傷及其機制的研究中，通過阻斷左頸總動脈建立 7 日齡雄性 Sprague-Dawley 新生大鼠 HIBD 模型。HIBD 組大鼠的活性氧水平顯著升高，鐵代謝相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 (TFRC)、鐵蛋白重鏈 (FHC)、鐵蛋白輕鏈 (FLC) 的蛋白水平顯著升高，而 SLC7A11、GSH、GPX4 的蛋白水平降低，這些變化導(dǎo)致細胞抗氧化能力下降、線粒體損傷，引起大腦皮層神經(jīng)元鐵死亡。

圖 7. 通過阻斷左頸總動脈建立 7 日齡雄性 Sprague-Dawley 新生大鼠 HIBD 模型后 72 小時腦組織中鐵死亡相關(guān)蛋白的水平^[7]。