CRISPR 技術是什么？

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相關蛋白 9 (Cas9) 系統(tǒng)是一種簡單快速有效的方法，可直接在細胞中對基因序列進行更改。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)源自簡單細菌免疫系統(tǒng)的組分，能夠在多種細胞中進行靶向基因切割和基因編輯。

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由于 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)中的核酸內切酶切割特異性由 RNA 序列引導，因此通過對向導 RNA (gRNA) 序列進行工程改造，并將其與 Cas9 核酸內切酶一起遞送至靶細胞內后，幾乎可以對任何基因組位點進行編輯。

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)能夠實現(xiàn)高度靈活性和特異性靶向性，可進行修飾和重定向，也已成為干細胞工程、基因治療、組織和動物疾病模型以及設計抗病轉基因植物等廣泛應用中的強大基因組編輯工具。賽默飛世爾科技的專家已整合該一系列資源，您可以放心地開始基因編輯或持續(xù)改進您的研究。

CRISPR 是如何工作的？

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)由非編碼短 gRNA 和 Cas9 核酸酶組成（圖 1）。gRNA 有兩個分子組分：一個靶點特異性 CRISPR RNA (crRNA) 和一個輔助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 單元將 Cas9 蛋白引導至特定基因組位點，Cas9 核酸酶在該位點誘導特定基因組靶序列的雙鏈斷裂（圖 2）。

圖 1.CRISPR gRNA 和 Cas9 蛋白。

圖 2.CRISPR-Cas9 系統(tǒng)。

在細菌中，CRISPR 位點由一系列重復序列組成，這些重復序列被 30bp 左右長度的外源 DNA 間隔開來，這些外源 DNA 稱為間隔區(qū)序列（spacer）。重復-間隔的陣列被轉錄為一條較長的前體RNA，其中的重復序列被加工并生成定義了靶標序列的短小 crRNA（也稱為前間區(qū)序列（protospacer）） - 靶序列據(jù)此被 Cas9 核酸酶切割。之后人們將CRISPR間隔區(qū)序列作為在DNA水平識別和沉默外源基因元件的工具。

重要的是，緊鄰靶區(qū)域 3'端下游的稱為原型間隔區(qū)相鄰基序 (PAM) 序列的特定三核苷酸序列必須存在才能發(fā)生切割。該 PAM 序列 (Cas9 的 NGG) 存在于靶 DNA 中，但不存在于靶向該 DNA 的 gRNA 中。

使用 CRISPR-Cas9 切割 DNA 后，雙鏈斷裂可以通過兩種細胞自然修復機制之一進行修復（圖 3）。

1. 在不存在修復模板的情況下，非同源末端連接(NHEJ) 過程會導致 gRNA 定義的斷裂周圍有不同插入或缺失（插入缺失）的異質細胞群?？衫迷撨^程在特定序列周圍生成有隨機缺失的細胞系，從而獲得功能性敲除。

2. 或者，如果提供了修復模板，則可以通過無差錯的同源定向修復 (HDR) 機制，在基因組內的特定位點引入用戶定義的序列變化。該過程可用于過表達新基因，建立疾病相關細胞模型或用可報告的基團標記內源性基因。

圖 3.CRISPR-Cas9 雙鏈斷裂和修復通路。切割反應同時發(fā)生于兩條鏈中靶序列的3’端 PAM 序列上游 NGG 的 3 個堿基對上。

使用 CRISPR-Cas9基因編輯技術的成功秘訣

如果選擇 CRISPR-Cas9 進行基因編輯工作流程，請確保了解使用本系統(tǒng)時可能會影響基因組編輯效率的因素。重要的是要考慮您的實驗設計，包括用于切割的核酸酶形式和 gRNA，將分子遞送到細胞中的轉染方法以及檢測基因編輯以適當驗證結果所需的檢測。

設計和構建

設計實驗時的關鍵注意事項 ：

? 為每個靶點設計和檢測 3 個 gRNAs

? 進行生物信息學分析，選擇預測的脫靶效應 gRNAs

? 靶向早期組成型外顯子，破壞基因敲除實驗的閱讀框

? 確保切割位點盡可能接近編輯位點，以進行敲入實驗

? 選擇適合實驗的 Cas9 核酸酶

遞送

進行細胞轉染時的關鍵考慮因素 ：

? 從最佳的細胞密度和細胞健康狀態(tài)開始

? 了解轉染細胞的最佳方法：脂質體、電穿孔轉染或病毒轉染

? 優(yōu)化遞送多分子時的數(shù)量比

? 轉染經(jīng)驗證的對照 gRNA，以檢測轉染效率和 Cas9 活性

? 提供修復模板，以便在 Cas9 激活時可進行  敲入實驗

檢測和驗證

檢測編輯時的主要考慮因素 ：

? 使用基因組切割檢測 (GCD) 試驗快速確認 gRNA 切割效率

? 選擇適合下游應用的檢測方法

? 如果需要遺傳同質細胞群，請分離克隆

? 要知道，基于插入缺失的敲除的 gRNA 通常是敲入的 gRNA

? 利用靶向測序驗證脫靶編輯

可用的 CRISPR 技術

賽默飛世爾科技提供一整套基因組編輯試劑（圖 4）。我們會根據(jù)您的應用和細胞類型，為這些基因編輯解決方案匹配最佳的細胞培養(yǎng)試劑、遞送方法以及分析工具。

圖 4.可用的 CRISPR-Cas9 核酸酶和 gRNA 形式。

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