PCR技術(shù)是什么？

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱為PCR，是分子生物學(xué)技術(shù)之一。20世紀(jì)70年代，研究人員報道了使用合成引物和DNA聚合酶從模板復(fù)制單鏈DNA。然而，直到1983年，Kary Mullis才發(fā)明出用于擴增目標(biāo)DNA的研究工具，就是我們今天所熟知的PCR方法。從此以后，PCR成為分子生物學(xué)研究的一部分，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷、農(nóng)業(yè)檢測和法醫(yī)調(diào)查等領(lǐng)域。而Kary Mullis也因這一發(fā)明獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎。

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ( PCR ) 是從目標(biāo)序列中生成數(shù)百萬拷貝核酸的過程。科學(xué)家已運用 PCR 儀 (也稱為熱循環(huán)儀) 復(fù)制了這種反應(yīng)。了解 PCR 儀自 20 世紀(jì) 80 年代面世以來的歷史，以及有助于改善 PCR 結(jié)果的 PCR 技術(shù)進(jìn)步。

PCR的原理

PCR是一種能夠在短時間內(nèi)將單個DNA分子擴增數(shù)百萬倍的生化過程。其擴增過程包括三個連續(xù)步驟：

（1）變性，對雙鏈DNA模板進(jìn)行加熱，使其解離；

（2）退火，被稱為引物的短DNA分子與目標(biāo)DNA的側(cè)翼區(qū)域結(jié)合；

（3）延伸，DNA聚合酶沿著模板鏈將引物3’端進(jìn)行延伸。將這些步驟重復(fù)（“循環(huán)”）25-35次，即可按指數(shù)方式獲得精確的目標(biāo)DNA拷貝（圖1）。

多年以來，PCR的基本原理一直未變，但隨著 DNA聚合酶和試劑性能的大幅提升，以及儀器和塑料耗材的不斷創(chuàng)新，PCR實驗方法也在不斷改進(jìn)。

圖 1.PCR的三個步驟——變性、退火和延伸——如第一個循環(huán)所示，目標(biāo)DNA隨重復(fù)循環(huán)而發(fā)生指數(shù)擴增。

DNA聚合酶

DNA聚合酶是PCR的重要組成部分，它們能夠從單鏈DNA模板合成新的互補鏈。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即摻入核苷酸并使引物從按5'至3’方向延伸（圖 2）。

早期的PCR，通常使用來源于 大腸桿菌 的DNA聚合酶I上的 Klenow片段 來生成新的子鏈。但是，這種 大腸桿菌酶對熱敏感，易受到變性階段高溫度的破壞，從而無法繼續(xù)進(jìn)行退火和延伸步驟。因此，需要在全程每個循環(huán)的退火步驟中重新補充酶。

熱穩(wěn)定DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)是一項重大進(jìn)步。它實現(xiàn)了長時間的反應(yīng)穩(wěn)定性，為PCR方法的改進(jìn)提供了無限可能。1976年，從耐熱菌 Thermus aquaticus 中分離出來的Taq DNA 聚合酶是最有名的熱穩(wěn)定DNA聚合酶之一。1988年研究人員報道，證明 Taq DNA 聚合酶能夠在 75°C以上保持活性，從而無需手動加入新鮮的酶即可持續(xù)循環(huán)擴增，實現(xiàn)了工作流程自動化。此外，與 大腸桿菌 DNA聚合酶相比， Taq DNA 聚合酶能夠獲得更長的PCR擴增子，并且具有更高的靈敏度、特異性和得率。也因此， Taq DNA 聚合酶被 《科學(xué)》 雜志評為1989年的“年度分子”。

盡管 Taq DNA 聚合酶大大改善了PCR實驗方法，但也表現(xiàn)出一些缺點。例如，TaqDNA 聚合酶在90°C以上的DNA鏈變性溫度中相對不穩(wěn)定。對于需要更高解離溫度的富含GC和/或具有強二級結(jié)構(gòu)的DNA模板而言，這一問題尤為明顯。同時， Taq DNA 酶還缺乏校正活性，會在擴增期間引入錯誤核苷酸。對于克隆和測序而言，序列的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，所以不能存在含有錯配的PCR擴增子。此外， Taq DNA 聚合酶的易錯配特性使其通常無法穩(wěn)定擴增長度大于5 kb的片段。為克服這些缺點，性能更好的DNA聚合酶不斷被開發(fā)出來，使PCR在廣泛的生物學(xué)應(yīng)用中發(fā)揮其強大的功能。

圖 2：DNA聚合酶沿5′至3′方向使PCR引物延伸。

PCR熱循環(huán)儀

熱循環(huán)儀是一種能夠為PCR反應(yīng)自動完成溫度循環(huán)和孵育的儀器。在引入熱循環(huán)儀之前，PCR反應(yīng)是一個費時費力的過程，需在不同溫度的水浴之間轉(zhuǎn)移樣品，并為每個步驟需要精確定時。熱循環(huán)儀和 Taq DNA 聚合酶的發(fā)現(xiàn)，讓PCR的自動化成為現(xiàn)實。第一款自動化PCR熱循環(huán)儀是在1985年由PerkinElmer和Cetus以合資方式引入市場的。此后， 熱循環(huán)儀 的實用性、設(shè)計、溫度控制和循環(huán)速度不斷得到改善。熱循環(huán)儀也為 定量PCR儀 的開發(fā)開拓了道路，定量PCR儀將PCR擴增和PCR產(chǎn)物累積的實時檢測結(jié)合在一起。

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