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分子膠的篩選案例詳解_MedChemExpress(MCE 中國(guó))
分子膠的作用機(jī)制是什么？已知的分子膠是如何被發(fā)現(xiàn)以及改造優(yōu)化的？為什么 CRBN 類分子膠的研究熱度最高？AI 能否助力分子膠的發(fā)現(xiàn)？本期小 M 將就這些問(wèn)題帶大家一探究竟~
分子膠（Molecular Glues）是一類能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的小分子，近年來(lái)可謂是醫(yī)藥圈的‘香餑餑’。據(jù)不全統(tǒng)計(jì)，2020 年以來(lái)禮來(lái)、輝瑞等各大藥企在分子膠領(lǐng)域已經(jīng)完成 24 筆大的交易，整體交易規(guī)模加起來(lái)高達(dá) 270 億美元。它們不僅擴(kuò)展了‘不可成藥’靶點(diǎn)的治療潛力，還為癌癥、神經(jīng)退行性疾病等難治性疾病提供了新的解決方案。
Section.01
分子膠的作用機(jī)制是什么？
如圖 1，分子膠通常通過(guò)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)相互靠近發(fā)揮作用，即誘導(dǎo)或增強(qiáng)兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用。這可能會(huì)產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，包括：(A) 降解靶蛋白(通過(guò)誘導(dǎo)靶蛋白與 E3 連接酶相互靠近)；(B) 穩(wěn)定靶蛋白-效應(yīng)蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；(C) 抑制酶的活性 (通過(guò)阻斷靶蛋白酶與其下游活動(dòng)所需的 Native binding partner 的結(jié)合)；(D) 激活靶蛋白的活性 (通過(guò)促進(jìn)靶蛋白與調(diào)節(jié)蛋白的相互作用，增強(qiáng)靶蛋白的活性)。
圖 1. 分子膠誘導(dǎo)蛋白相互作用功能示意圖[1]。
Section.02
已知的分子膠是如何被發(fā)現(xiàn)
以及改造優(yōu)化的？
小 M 為大家整理了 3 類高效篩選分子膠的案例，其基本研究思路為：① 構(gòu)建分子膠類似物化合物庫(kù); ② 通過(guò)高通量篩選獲得苗頭分子; ③ Western blot 驗(yàn)證被降解的目標(biāo)蛋白; ④ AlphaScreening 或 NanoBit 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用; ⑤ HiBiT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白含量以獲得 DC50 (半數(shù)降解濃度) 和 Dmax (最大降解率)。
利用高通量表型篩選出一類分子膠降解劑，該分子膠可以誘導(dǎo)胎兒血紅蛋白 (HbF) 的表達(dá)，為治療鐮狀細(xì)胞病等血紅蛋白相關(guān)疾病提供了新的候選藥物。
研究人員開(kāi)發(fā)了一種基于高通量流式細(xì)胞術(shù)的表型篩選方法，使用人源 CD34+ 細(xì)胞衍生的成紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)篩選胎兒 HbF 誘導(dǎo)劑。研究人員篩選了一個(gè)包含 2,814 種基于 CRBN 的分子膠類似化合物庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了一組能夠增加 HbF 陽(yáng)性細(xì)胞比例的化合物 (如圖 2)，同時(shí)不影響成紅細(xì)胞的增殖和分化。這種表型在之前已知的 HbF 誘導(dǎo)劑類別中很少見(jiàn)。
圖 2. 表型篩選流程與結(jié)果分析[2]。
隨后進(jìn)一步基于全局蛋白質(zhì)組學(xué)分析識(shí)別出在化合物 1 的處理下顯著變化的蛋白質(zhì)，圖 3A 表明化合物 1 是通過(guò) CRBN 依賴性降解轉(zhuǎn)錄因子 WIZ，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)了體外 HbF 誘導(dǎo)。圖 3B 表明化合物 1 能夠顯著降解 WIZ 并誘導(dǎo) HbF，因此被選為優(yōu)化的起點(diǎn)。
圖 3. 驗(yàn)證化合物 1 的作用靶點(diǎn)[2]。
(a) log2 (倍數(shù)變化) 和 p 值的雙重標(biāo)準(zhǔn)，確保篩選結(jié)果的可靠性和顯著性)，(b) 體外活性分析。
接下來(lái)，研究人員對(duì)化合物 1 進(jìn)行了簡(jiǎn)單的改造得到化合物 2，該化合物同樣能夠以 CRBN 依賴的方式強(qiáng)效誘導(dǎo)胎兒 HbF 并降解 WIZ，隨后研究人員進(jìn)一步評(píng)估化合物 1 和化合物 2 的理化性質(zhì)和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，如圖 4 所示，化合物 2 表現(xiàn)出更好的口服生物利用度 (BA%last = 12%)，因此后續(xù)以化合物 2 作為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的先導(dǎo)分子。
表 1. 化合物 1 和化合物 2 的 ADME/PK 數(shù)據(jù)[2]。
戊二酰亞胺是 CRNB 分子膠降解劑的關(guān)鍵片段，研究人員開(kāi)發(fā)一種利用多組分反應(yīng)作為核心模塊化步驟合成含戊二酰亞胺分子膠庫(kù)的方法。通過(guò)對(duì)合成的化合物庫(kù)進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)了靶向酪蛋白激酶 1α (CK1α) 和 Wee 樣蛋白激酶 (WEE1) 的分子膠降解劑。并且通過(guò)分子對(duì)接和結(jié)構(gòu)分析，為進(jìn)一步優(yōu)化分子膠提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
研究人員首先設(shè)計(jì)了一種新的化學(xué)合成策略，即利用 GBB 反應(yīng) (Groebke?Blackburn?Bienayme，一種多組分縮合反應(yīng)) 作為最后一步關(guān)鍵的合成步驟，快速高效地獲得 200 多個(gè)結(jié)構(gòu)多樣的 CRBN 分子膠庫(kù)。
圖 4. 基于多組分反應(yīng) (GBB reaction) 一步合成含 HRZ 骨架的化合物庫(kù)[3]。
隨后，研究人員在 CRBN 野生型和 CRBN 敲除的 MOLT-4 細(xì)胞 (人白血病細(xì)胞) 中進(jìn)行 72 小時(shí)的細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)，以篩選出以 CRBN 依賴性方式誘導(dǎo)強(qiáng)效抗增殖的化合物，結(jié)果找到 3 個(gè)苗頭分子，其中化合物 2 的 EC50 低于 5 nM，化合物 1 和 3 的 EC50 分別為 12 nM 和 139 nM。
圖 5. 3 個(gè)苗頭分子結(jié)構(gòu)[3]。
接下來(lái)，研究人員基于化合物 2 來(lái)識(shí)別靶點(diǎn)，通過(guò)全細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析 (whole-cell proteome profiling) 檢測(cè)化合物 2 處理 MOLT-4 細(xì)胞 5 小時(shí)后的蛋白變化，發(fā)現(xiàn) CK1α (酪蛋白激酶 1α) 和 WEE1 (細(xì)胞周期調(diào)控激酶) 是主要降解靶點(diǎn)，并通過(guò) Western blot 確認(rèn)化合物 1，2，3 是 CRBN 依賴的 CK1α 和 WEE1 降解劑。
圖 6. 全細(xì)胞蛋白組學(xué)結(jié)果分析圖 (CSNK1A1 即為 CK1α) 以及 Western blot 驗(yàn)證圖[3]。
隨后研究人員開(kāi)始進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以化合物 1 作為改構(gòu)起點(diǎn)。為了方便構(gòu)效關(guān)系分析，研究人員引入 HiBit 標(biāo)簽，以定量監(jiān)測(cè) Jurkat 細(xì)胞 (T 細(xì)胞白血病細(xì)胞) 中內(nèi)源性 WEE1 和 CK1α 蛋白的水平，將經(jīng)過(guò)改造的細(xì)胞系與不同濃度的化合物一起孵育 5 小時(shí)，然后通過(guò)終點(diǎn)熒光素酶測(cè)定法來(lái)檢測(cè)靶點(diǎn)的降解情況獲得 DC50 和 Dmax。改構(gòu)主要基于傳統(tǒng)的藥化改構(gòu)思路，圍繞化合物 1 的骨架進(jìn)行較小的改動(dòng)，以獲得活性和選擇性更好的化合物，最終得到化合物 10 是活性好的分子。
表 2. HRZ-1 骨架苯胺取代基的 SAR 分析[3]。
值得一提的是，研究人員還通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 2 個(gè)重要的問(wèn)題，第一個(gè)問(wèn)題是已報(bào)道的認(rèn)為 CRBN 分子膠都是通過(guò)一個(gè)由含有甘氨酸殘基的 β 發(fā)夾環(huán) (G loop) 的降解標(biāo)簽基序來(lái)與新底物結(jié)合的，研究人員分別測(cè)試了化合物 10 對(duì)野生型 WEE1 (WEE1-WT)、甘氨酸 322 突變?yōu)楸彼岬?WEE1 (WEE1-G322A) 以及甘氨酸 322 突變?yōu)樘於０返?WEE1 (WEE1-G322N) 的降解變化，結(jié)果和已報(bào)道的結(jié)論一致，WEE1-G322N 突變阻止了 WEE1 的降解。
第二個(gè)問(wèn)題是化合物 10 是如何介導(dǎo) WEE1 與 CRBN-DDB1 結(jié)合，通過(guò) cryo-EM 獲得 WEE1-化合物 10-CRBN-DDB1 的復(fù)合物結(jié)合模式，結(jié)果顯示 WEE1 的 G loop 對(duì)介導(dǎo)三元復(fù)合物的形成很重要。與此同時(shí)，盡管化合物 10 具有高親和力，但它與復(fù)合物的結(jié)合并沒(méi)有使整個(gè)復(fù)合物變得剛性。如圖 7，化合物 10 主要存在兩種可能的構(gòu)象，且通過(guò)對(duì)化合物 13 進(jìn)行分子對(duì)接顯示：化合物 10 和 13 的 pose 基本和 fit1 一致。作者又將 WEE1-化合物 10-CRBN-DDB1 復(fù)合物與已報(bào)道的 DDB1-CRBN-SJ3149-CK1α 復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行疊合。在化合物 10 的兩種可能結(jié)合模式中，咪唑并吡啶和金剛烷基取代基都與 SJ3149 的苯并惡唑部分部分重合，這為進(jìn)一步優(yōu)化分子膠提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
構(gòu)建靶向 VHL 的 CIP-DEL 篩選文庫(kù)，該文庫(kù)包含約 938,730 個(gè)化合物。開(kāi)發(fā)一種基于親和力的 CIP-DEL 篩選方法，利用“呈遞蛋白比率”來(lái)理性篩選具有高協(xié)同性的小分子化合物，對(duì)分子膠的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。
諾華的研究人員參考已報(bào)道的 BRD7/BRD9 降解劑 VZ185 的 VHL 配體的連接方式，通過(guò)酚氧基團(tuán)構(gòu)建基于三嗪的多樣化 DEL 文庫(kù)，DNA headpiece 和 DNA tag 連接在靶向 VHL 配體的遠(yuǎn)端酰胺上。
基于三輪建庫(kù)，第一輪在三嗪和靶向 VHL 的配體之間引入 13 種連接子，第二輪和第三輪分別在三嗪骨架上引入 290 種和 249 種不同分子砌塊，最終構(gòu)建了一個(gè)包含 938,730 個(gè)分子的 DEL 篩選文庫(kù)。
圖 8. VHL CIP-DEL 文庫(kù)核心骨架[4]。
在 CIP-DEL 篩選試驗(yàn)中，首先將 His-tag 的 BRD9 (靶蛋白) 固載在磁珠上，并使用 2 種不同的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)鑒定潛在的分子膠。如圖 10 所示，將文庫(kù)和固載的 BRD9 蛋白孵育 (允許形成二元復(fù)合物)，文庫(kù)首先和 VCB (VHL–elongin C–elongin B) 預(yù)孵育，再和固載的 BRD9 蛋白孵育 (允許形成三元復(fù)合物)。為了控制非特異性結(jié)合，在不存在 BRD9 的情況下，將文庫(kù)和磁珠孵育。洗滌 3 次后，加熱使蛋白質(zhì)變性以釋放結(jié)合物，再將 DNA 條形碼進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序以鑒定結(jié)合物的結(jié)構(gòu)。
圖 9. DEL 篩選流程[4]。
為了計(jì)算富集，研究人員將 DNA 條形碼的計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)建模為 Poisson 抽樣，通過(guò)這種建模方式，研究人員能根據(jù)總樣本計(jì)數(shù)對(duì)各個(gè)計(jì)數(shù)進(jìn)行歸一化處理，同時(shí)也會(huì)考慮到測(cè)序數(shù)據(jù)的不確定性。二元富集度通過(guò) BTL 的計(jì)數(shù)值除以 BL 的計(jì)數(shù)值來(lái)計(jì)算，三元富集度通過(guò) BTLP 的計(jì)數(shù)值除以 BL 的計(jì)數(shù)值來(lái)計(jì)算，而呈遞蛋白比率則通過(guò) BTLP 的計(jì)數(shù)值除以 BTL 的計(jì)數(shù)值來(lái)計(jì)算，本質(zhì)上得到的是三元富集度與二元富集度的比值。呈遞蛋白比率越高，表明 CIP-DEL 化合物與 BRD9 的結(jié)合越依賴于 VCB 的存在，這意味著該化合物具有更高的協(xié)同性。研究假設(shè)可以利用呈遞蛋白比率來(lái)篩選在與 BRD9 和 VCB 形成三元復(fù)合物時(shí)具有不同協(xié)同程度的小分子。
如圖 11，研究人員將結(jié)果分為三類：第一類是三元復(fù)合物富集度高但呈遞蛋白比率低 (主要是帶有 9 號(hào)連接子 (珊瑚色) 和 12 號(hào)連接子 (藍(lán)色) 化合物)，第二類是三元復(fù)合物富集度中等和呈遞蛋白比率中等的化合物 (11 號(hào)連接子 (黃色) 化合物)，第三類是三元復(fù)合物富集度低和呈遞蛋白比率高的化合物 (主要是 13 號(hào)連接子 (綠色) 化合物)。
圖 10. 三元復(fù)合物富集度與呈遞蛋白比率的關(guān)系圖[4]。
后續(xù)通過(guò) AlphaScreen 進(jìn)行協(xié)同性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)化合物 13-3 和 13-7 無(wú)鉤狀效應(yīng)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中，13-7 在 NanoBiT 實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)三元復(fù)合物形成且無(wú)鉤狀效應(yīng)，在 HiBit 實(shí)驗(yàn)中對(duì) BRD9 的降解也無(wú)鉤狀效應(yīng)，且具有較好的選擇性。
圖 11. AlphScreen, NanoBiT 和 HiBiT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖[4]。
Section.03
為什么 CRBN 類分子膠的
研究熱度最高？
一家專注于分子膠降解劑開(kāi)發(fā)的公司 Monte Rosa Therapeutics 對(duì) CRBN 的底物進(jìn)行了更廣泛的探索。已知的 Neo-substrate 有 CK1α、GSPT1、IKZF1、IKZF2、WIZ 等，這些都是傳統(tǒng)意義上的難成藥靶蛋白。這些 Neo-substrate 通過(guò)一個(gè) G-loop 與 CRBN/CELMoD 結(jié)合，G-loop 由 β-hairpin α-turn 構(gòu)成，在特定位置有一個(gè)共同的甘氨酸，因此也被稱為 β-hairpin G-loop。
研究人員首先以 CK1α 的 β-hairpin G-loop 作為查詢模板 (該模板由 I35 到 E42 八個(gè)氨基酸組成，包含 5 個(gè)上游殘基 (G-5) 和 2 個(gè)下游殘基 (G+2))，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù) (PDB) 和 AlphaFold2 (AF2) 預(yù)測(cè)的人類蛋白質(zhì)中進(jìn)行搜索。選擇與查詢模板的均方根偏差 (RMSD) 小于 0.75? 且與 CRBN 無(wú)空間位阻基序，并去除其中主要定位于細(xì)胞外的蛋白質(zhì)，最終確定了 1,424 種含有 CRBN 兼容 β-hairpin G-loop 的蛋白質(zhì)。除此之外，還發(fā)現(xiàn)一種新的 helical G-loop 基序，存在于 184 種蛋白質(zhì)中，進(jìn)一步擴(kuò)展了 CRBN-neosubstrate 的范圍。
圖 12. β-hairpin G-loop 模版數(shù)據(jù)挖掘示意圖[5]。
Section.04
AI 能否助力分子膠的發(fā)現(xiàn)？
一直以來(lái)，分子膠的計(jì)算評(píng)估是一大難點(diǎn)，這包括三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，DC50 和親和力難以有很強(qiáng)的相關(guān)性。
3 月 22 日，VantAI 給制藥行業(yè)帶來(lái)了振奮人心的消息，推出 NEO-1 模型，該模型被譽(yù)為藥物研發(fā)領(lǐng)域一款具有開(kāi)創(chuàng)性的人工智能模型。NEO-1 不僅能夠預(yù)測(cè)生物分子結(jié)構(gòu)，還能從頭生成分子，尤其是具備從頭生成分子膠方面的能力。大家感興趣可以去進(jìn)一步了解 vant.ai/neo-1。截止今日，該模型還無(wú)法試用且無(wú)公開(kāi)的文獻(xiàn)，小 M 很期待該模型能公開(kāi)，到時(shí)跟大家再進(jìn)一步分享。
圖 13. 歷代結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型能力[6]。
MCE 一站式藥篩平臺(tái)聚焦于藥物發(fā)現(xiàn)早期，可為客戶提供多樣化的分子膠化合物庫(kù) (HY-L918 & HY-L137)，HY-L918 分子膠類似物庫(kù)由基于CRBN，VHL和DCAF14的分子膠類似物構(gòu)成。同時(shí)可提供 DEL 定制和篩選服務(wù)，蛋白定制服務(wù)，表型篩選服務(wù)以及分子膠的合成定制服務(wù)等，為科研客戶及新藥研發(fā)客戶提供—站式分子膠發(fā)現(xiàn)及研究服務(wù)。
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[1] Holdgate, Geoffrey A. et al. SLAS Discovery, Volume 29, Issue 2, 100136
[2] John Ryan Kerrigan, Noel M.et al. Journal of Medicinal Chemistry 2024 67 (22), 20682-20694
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[5] Georg Petzold.et al. bioRxiv 2024.10.07.616933
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