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免疫組化實驗是一項精密的技術操作，需要嚴格把控各個環(huán)節(jié)以確保結果的準確性和可靠性。以下是免疫組化實驗的關鍵注意事項：
一、血清封閉
血清封閉的目的是為了一抗與組織的非特異性結合，造成假陽性，一般會采用BSA、羊血清等封閉這些位點，封閉血清一般是和二抗同一來源的，室溫封閉10-30min。
二、一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間
不同的一抗?jié)舛龋跤龝r間和溫度等對染色結果往往有較大的影響。在4℃下，反應緩慢，背景較淺；而37℃反應較快，時間較短；室溫介于兩者之間，二抗一般室溫孵育30min。
三、DAB顯色
檢測背景的深淺和特異性染色的深淺基本上都以DAB孵育條件決定。DAB的顯色時間并不是固定的，主要方法是使用顯微鏡控制顯色時間，到出現(xiàn)特異性染色較強且出現(xiàn)背景著色較淺時就可以沖洗。如果DAB顯色時間過長（超過十分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時間過長，也可以加入金屬離子來增強顯色（如硫酸銅、氯化鈷、硫酸鎳銨等）；如果DAB顯色時間過短顏色就很深，這可能是一抗過高，需要下調抗體濃度，如果短時間內過深
四、復染
免疫組化染色后為了襯托出組織形態(tài)結構有必要進行復染，常用試劑為Mayer’s蘇木染色，一般為2 min左右，DAB在核蛋白著色的時間可以適當縮短，最后用氨水或PH 8.0的TBS返藍。
五、封片
在封片階段我們通常是用中性樹膠來進行，封片過程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡的產生從而對結果進行營影響，建議最好在通風櫥操作，這樣有利于氣泡排除干凈，不影響后續(xù)的鏡檢。
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