本文要點：腸道屏障完整性的動態(tài)變化與多種疾病的發(fā)生及進展密切相關(guān)，對其精準檢測與實時監(jiān)測可為優(yōu)化治療方案提供關(guān)鍵信息。本研究開發(fā)了一種基于谷胱甘肽包裹金納米簇（Au-GSH）的雙功能策略，通過體內(nèi)近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像與體外比色尿液分析相結(jié)合，實現(xiàn)腸道屏障完整性的無創(chuàng)檢測與動態(tài)監(jiān)測。經(jīng)口服后，Au-GSH的體內(nèi)分布行為可隨腸道屏障完整性狀態(tài)發(fā)生顯著改變：當屏障受損時，其超小尺寸（低于腎小球濾過截留閾值）可選擇性滲透至膀胱，并通過尿液快速排出。這一過程可通過實時無創(chuàng)采集Au-GSH的NIR-II熒光信號（>1100 nm）進行可視化追蹤。此外，基于Au-GSH的類過氧化物酶活性建立的比色尿液分析體系進一步提升了檢測靈敏度與定量能力。實驗表明，該策略成功檢測到潰瘍性結(jié)腸炎（UC）小鼠模型中典型的腸道屏障損傷特征，并實現(xiàn)了對治療性及預(yù)防性干預(yù)模式下屏障修復(fù)過程的動態(tài)監(jiān)測。該技術(shù)為腸道屏障相關(guān)疾病的診斷與療效評估提供了新型研究方法。

動物活體成像系統(tǒng)

本文通過簡單的一步反應(yīng)，合成了具有近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光發(fā)射、腎臟排泄行為及類過氧化物酶活性的金-谷胱甘肽分子簇（Au-GSH）（圖1a），其可通過體內(nèi)NIR-II熒光成像與體外比色尿液分析同步實現(xiàn)腸道屏障完整性的無創(chuàng)檢測與監(jiān)測（圖1b）。值得注意的是，口服Au-GSH后，僅當腸道屏障完整性受損時，Au-GSH才能高效滲透屏障進入膀胱并通過尿液排出。這一過程可通過實時無創(chuàng)采集Au-GSH發(fā)射的>1100 nm的近紅外熒光信號進行體內(nèi)NIR-II熒光成像可視化追蹤。基于Au-GSH的類過氧化物酶活性，進一步建立了簡易的尿液比色檢測方法以評估腸道屏障完整性，從而提升了檢測性能。此外，基于Au-GSH的NIR-II熒光成像與比色尿液分析策略成功實現(xiàn)了對受損腸道屏障完整性修復(fù)過程的監(jiān)測，展現(xiàn)出在臨床實踐中評估腸道屏障完整性相關(guān)疾病預(yù)后的巨大潛力。

本文采用谷胱甘肽（GSH）作為封端劑，通過簡單的一步還原法制備了Au-GSH。獲得Au-GSH后，開始評估其用于基于NIR-II熒光成像和比色尿液分析的腸道屏障完整性檢測與監(jiān)測的關(guān)鍵特性。首先，分析了Au-GSH的光物理性質(zhì)。其紫外-可見-近紅外（UV–vis–NIR）吸收光譜（圖2a）顯示出一條延伸至900 nm的下降曲線，無特征峰，這與典型的金簇吸收特性一致。在808 nm波長激光激發(fā)下，發(fā)射光譜顯示Au-GSH在NIR-II窗口（1000–1400 nm，圖2a）內(nèi)發(fā)光，峰值位于1047 nm。良好的光穩(wěn)定性是體內(nèi)熒光成像的前提。

圖2. Au-GSH顯示出NIR-II熒光發(fā)射能力、快速腎臟排泄行為和過氧化物酶樣催化活性

鑒于GSH優(yōu)異的抗污能力可屏蔽內(nèi)源性蛋白質(zhì)吸附，且透射電鏡（TEM）圖像（圖2c）直觀證實Au-GSH超小尺寸（約4.5 nm，低于腎小球濾過截留閾值~5.5 nm），對Au-GSH具備快速腎臟排泄?jié)摿φ归_評估。通過靜脈注射Au-GSH后，在小鼠腹側(cè)進行NIR-II窗口（>1100 nm）實時熒光成像（圖2d），結(jié)果顯示：注射后熒光信號迅速定位于膀胱，10分鐘開始顯著積累，1小時后膀胱信號減弱并伴隨尿液中NIR-II熒光出現(xiàn)。隨時間推移，膀胱部位熒光強度逐漸降低，6小時大部分消退，24小時消失。NIR-II成像直觀表明Au-GSH主要通過尿液排泄，其他組織無顯著蓄積?；诖耍占⑸浜?4小時尿液分析排泄動力學（圖2e），發(fā)現(xiàn)約85%的Au-GSH在此時間段內(nèi)排出，其中80%在6小時內(nèi)已清除（圖2f），證實其快速排泄特性及低體內(nèi)滯留毒性。

基于Au-GSH腎臟排泄行為及先前發(fā)現(xiàn)的納米金簇人工酶活性，本研究進一步探索其類過氧化物酶催化活性，以期建立圖2g所示比色尿液分析方法，輔助NIR-II成像技術(shù)以提升腸道屏障完整性檢測性能。實驗顯示，當Au-GSH與H?O?共存時，TMB溶液可由無色變?yōu)樗{色，并在652 nm處吸光度（A???）達到峰值（圖2h,i），表明Au-GSH催化H?O?產(chǎn)生活性羥基自由基（OH•）氧化TMB生成藍色產(chǎn)物，印證其酶活性。通過優(yōu)化反應(yīng)時間、化合物（NaCl、H?O?）濃度及環(huán)境pH等條件，建立比色檢測體系，其催化活性與Au-GSH濃度呈強相關(guān)性（Pearson’s r=0.9987；圖2j）。隨后驗證該方法的可行性：注射Au-GSH后1、3、12、24小時收集尿液，基于催化活性計算排泄量并與ICP-MS（金屬定量金標準）結(jié)果對比，顯示二者高度相關(guān)（Pearson’s r=0.7365），證實比色法可簡便、定量且低成本檢測尿液中Au-GSH濃度（圖2k）。綜上，Au-GSH的快速腎臟清除行為可通過無創(chuàng)實時NIR-II成像及簡易體外比色尿液分析精準表征。

圖3. Au-GSH用于分析腸屏障完整性的可行性

之后進一步探索其在評估腸道屏障完整性中的可行性。首先評估了Au-GSH的細胞生物相容性：將不同濃度的Au-GSH與不同細胞共孵育12或24小時后（圖3a,b），未觀察到細胞毒性，表明其適用于后續(xù)體外實驗。之后，評估了Au-GSH在模擬胃液（SGF）、模擬腸液（SIF）及全胃腸道消化條件（GI：SGF中2小時，隨后SIF中3小時）下的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，不同條件下，Au-GSH的熒光強度僅減弱約10%（圖3c,d），且尺寸無明顯變化（圖3e及S8），證實其優(yōu)異的穩(wěn)定性。

為評估Au-GSH對腸道屏障完整性的表征能力，采用Transwell系統(tǒng)建立模擬腸道屏障的Caco-2單層模型（圖3f）。當跨上皮電阻（TEER，評估Caco-2單層完整性的常用指標）超過300 Ω·cm2時，形成完整的腸道屏障模型（IIB）。通過右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）處理IIB單層24小時誘導(dǎo)損傷，建立DSS損傷型腸道屏障（DIB），表現(xiàn)為TEER顯著降低。隨后，將Au-GSH分別加入IIB和DIB的頂側(cè)（AP，細胞層上方），并于基底外側(cè)（BL，半透膜下方）每20分鐘取樣（持續(xù)120分鐘），通過NIR-II熒光定量檢測透過單層的Au-GSH含量。結(jié)果表明：對于IIB，基底側(cè)樣品中未檢測到熒光，表明Au-GSH幾乎無法穿透完整屏障；而DIB的基底側(cè)樣品熒光隨時間逐漸增強（圖3g），顯示Au-GSH可自由擴散透過受損屏障。以上結(jié)果證明，Au-GSH的滲透行為與腸道屏障完整性密切相關(guān)，為其體內(nèi)評估腸道屏障狀態(tài)奠定了堅實基礎(chǔ)。

圖4. 基于Au-GSH的同時NIR-II熒光成像和比色尿液分析，用于精確檢測腸道屏障的完整性

利用上述已驗證的Au-GSH優(yōu)勢，建立一種雙模式檢測策略，該策略同時實現(xiàn)了體內(nèi)無創(chuàng)實時近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像以及體外簡單快速的比色尿液分析，以評估疾病狀態(tài)下腸道屏障完整性的變化（圖1b）?？紤]到潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種以腸道屏障完整性缺陷為特征的炎癥性腸病，選擇其作為代表性疾病來展示該策略。建立了如圖4a所示的DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠模型以模擬UC。為了模擬不同程度的腸道屏障損傷，小鼠被均等分為三個不同組別：從第1天至第7天口服3% DSS（標記為7天組）、從第3天至第7天口服3% DSS（標記為5天組），以及全程飲用水（標記為正常組），隨后在第8天口服Au-GSH進行NIR-II熒光成像。同時，收集灌胃給藥后24小時內(nèi)排出的尿液，按照上述方法進行比色尿液分析（圖2g–k）。

觀察到的顯著體重下降（圖4b）與疾病活動指數(shù)（DAI）的明顯升高（圖4c）間接證實7天組UC模型成功建立。相較于7天組，5天組中觀察到的體重下降趨勢與DAI升高較為輕微，表明腸道屏障完整性僅受到微小損傷。令人欣喜的是，正常組與5天組小鼠經(jīng)Au-GSH給藥后僅腸道內(nèi)可清晰觀察到NIR-II熒光信號，而7天組小鼠在口服給藥后6–8小時不僅腸道內(nèi)顯現(xiàn)熒光，膀胱區(qū)域也出現(xiàn)顯著明亮熒光（圖4d）。肉眼可輕松捕捉到7天組小鼠尿液樣本使比色檢測溶液從無色迅速轉(zhuǎn)為藍色（圖4e,f），而正常組與5天組尿液樣本未引發(fā)變化，表明開發(fā)的比色尿液分析法無需儀器輔助即可簡單快速區(qū)分疾病狀態(tài)、亞健康狀態(tài)與正常狀態(tài)，從而進一步提升檢測精度。

如圖4g,h所示，正常組小鼠腸道呈現(xiàn)健康結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為完整的結(jié)腸上皮、緊密排列的腸隱窩及豐富的杯狀細胞。相比之下，7天組小鼠腸道黏膜嚴重受損，特征為腸隱窩分支、排列紊亂及杯狀細胞數(shù)量減少，而5天組小鼠杯狀細胞減少程度較低，黏膜層與隱窩損傷較輕，顯示損傷模式較輕微?；谏鲜鲅芯浚ㄟ^免疫熒光染色評估各組小鼠腸道中緊密連接蛋白（作為腸黏膜上皮細胞間主要連接結(jié)構(gòu)，對維持腸道屏障機械完整性與正常功能至關(guān)重要）的表達水平。如圖4i–l所示，7天組緊密連接蛋白（即occludin，圖4j；ZO-1，圖4l）表達水平顯著低于5天組與正常組，直接證實了腸道屏障完整性的破壞。綜合結(jié)果表明，基于Au-GSH的比色尿液分析法能夠以簡便、定量且經(jīng)濟高效的方式精準檢測腸道屏障完整性的動態(tài)變化。

圖5. 通過NIR-II熒光成像和比色尿檢精確監(jiān)測腸屏障恢復(fù)的進展

為進一步探索該策略在腸道屏障完整性修復(fù)監(jiān)測中的潛力，首先建立潰瘍性結(jié)腸炎（UC）治療模型：小鼠連續(xù)7天口服3% DSS后，分別接受5-氨基水楊酸（一線治療藥物ASA）治療3天或7天（標記為3天-ASA組與7天-ASA組），并通過NIR-II熒光成像與比色尿液分析全程監(jiān)測修復(fù)進程（圖5a）。未接受ASA或DSS處理的小鼠分別作為模型組與正常組。結(jié)果顯示，所有3% DSS處理小鼠均出現(xiàn)體重下降（圖5b）、DAI升高（圖5c）、便血腹瀉等癥狀，證實UC模型成功構(gòu)建。ASA治療后，與模型組相比，治療組體重回升與DAI下降顯著改善（圖5b,c），其中7天-ASA組恢復(fù)效果更顯著（p < 0.001），表明腸道屏障修復(fù)程度隨時間延長而增強。NIR-II熒光成像與尿液比色分析顯示，ASA治療后腸道至膀胱的Au-GSH分布量減少，直觀反映屏障完整性逐漸恢復(fù)（圖5d）。該方法成功區(qū)分不同療程（0、3、7天）的修復(fù)效果：隨著治療時間延長，尿液比色讀數(shù)逐步降低并趨近正常組水平（圖5e,f）。推測短期治療（3天）僅部分修復(fù)屏障缺陷，導(dǎo)致部分Au-GSH仍可穿透進入循環(huán)系統(tǒng)；而7天治療則有效阻斷Au-GSH入血，提示屏障功能接近恢復(fù)。利用H&E染色（圖5g）與AB-PAS染色（圖5h）結(jié)果與NIR-II熒光成像和比色尿液分析對比（圖5d–f）高度吻合，證實該策略可用于實時監(jiān)測腸道屏障完整性的動態(tài)修復(fù)進程。

圖6. 分析UC預(yù)防模式下腸道屏障完整性的變化

如圖6a所示，實驗將小鼠隨機分為兩組：模型組與AFP組（圖6b,c）。Au-GSH給藥后，NIR-II熒光成像顯示小鼠胃腸道出現(xiàn)顯著信號。值得注意的是，給藥4小時后，模型組小鼠膀胱與腸道均檢測到熒光信號，而正常組與AFP組熒光信號僅局限于腸道區(qū)域（圖6d），表明AFP有效抑制DSS引發(fā)的腸道屏障破壞。比色尿液分析進一步驗證上述結(jié)論：模型組尿液加入顯色劑后快速變?yōu)樗{色（源于Au-GSH存在），而AFP組與正常組尿液未發(fā)生明顯顏色變化（圖6e,f）。該結(jié)果與熒光成像數(shù)據(jù)一致，證明AFP通過維持腸道屏障完整性發(fā)揮UC預(yù)防作用。H&E染色（圖6g）與AB-PAS染色（圖6h）結(jié)果表明，模型組結(jié)腸黏膜損傷嚴重且杯狀細胞數(shù)量顯著減少；而AFP組黏膜與隱窩結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，杯狀細胞數(shù)量恢復(fù)至接近正常水平，有效維持了腸道屏障完整性。該結(jié)論與NIR-II熒光成像及比色尿液分析結(jié)果一致，進一步驗證了AFP的UC預(yù)防作用。

本研究提出了一種基于Au-GSH的整合式診斷策略，通過活體實時近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像與外周快速比色尿液分析的無創(chuàng)聯(lián)用，實現(xiàn)了腸道屏障完整性的精準檢測與動態(tài)監(jiān)測。Au-GSH在胃腸道及復(fù)雜生理環(huán)境中均展現(xiàn)出優(yōu)異穩(wěn)定性，其可在>1100 nm的NIR-II窗口發(fā)射強熒光信號，并具有類過氧化物酶活性。當腸道屏障完整時，Au-GSH被限制于腸腔內(nèi)；而當屏障受損時，其憑借小于腎排泄閾值（~4.5 nm）的粒徑可穿透腸壁進入血液循環(huán)并經(jīng)腎臟快速排出。基于Au-GSH的酶活性特性，本研究開發(fā)了直接通過尿液顯色反應(yīng)評估腸道屏障狀態(tài)的比色檢測方法。該方法通過肉眼可辨的顏色信號拓寬了應(yīng)用場景，同時提升了檢測精度。Au-GSH優(yōu)異的生物相容性進一步驗證了其臨床轉(zhuǎn)化潛力。該策略成功應(yīng)用于UC小鼠模型中不同損傷程度的腸道屏障狀態(tài)區(qū)分與表征，為腸道屏障完整性相關(guān)疾病的診斷提供了新型整合式平臺。

參考文獻

Zhang L, Feng L, Yang L, et al. Noninvasive Detection and Monitoring of the Integrity of the Intestinal Barrier through NIR-II Fluorescence Imaging and Colorimetric Urinalysis[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2025, 17(9): 13445-13460.

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動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

In Vivo Imaging System

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 恒光智影

上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評為“國家高新技術(shù)企業(yè)”，“上海市專精特新中小企業(yè)”，榮獲“科技部重大儀器專項立項項目”，上海市“科技創(chuàng)新行動計劃”科學儀器領(lǐng)域立項單位。

恒光智影，致力于為生物醫(yī)學、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供先進的、一體化的成像解決方案。

專注動物活體成像技術(shù)，成像范圍覆蓋 400-1700 nm，同時可整合CT, X-ray，超聲，光聲，光熱成像等技術(shù)。

可為腫瘤藥理、神經(jīng)藥理、心血管藥理、大分子藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫(yī)藥與科學儀器服務(wù)。