傳統(tǒng)的視覺方法觀察溶液中病毒顆粒只能獲取極小樣本量的瞬時圖像，而基于動態(tài)光散射的顆粒分析技術(shù)則能獲得溶液中顆粒粒徑的整體平均值。目前，如何準(zhǔn)確獲得實(shí)驗室培養(yǎng)病毒的顆粒粒徑數(shù)據(jù)是一項不小的挑戰(zhàn)，因為他們必須在含有白蛋白和其他小分子蛋白（如胎牛血清FBS或最低必需培養(yǎng)基MEM中的成分）的細(xì)胞培養(yǎng)基中增殖。當(dāng)病毒顆粒從細(xì)胞中釋放出來時，體積較大的細(xì)胞碎片可通過離心分離，但培養(yǎng)基中的小分子蛋白質(zhì)無法被去除。通過精確選擇動態(tài)光散射實(shí)驗的分布參數(shù)，即使在含有培養(yǎng)基中較小蛋白質(zhì)的背景下，仍能準(zhǔn)確分析出病毒顆粒的粒徑分布。

許多魚類病毒有可能對觀賞和經(jīng)濟(jì)類魚類種群造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。本文將重點(diǎn)研究以下四種病毒類型，并附上各病毒科的典型結(jié)構(gòu)示意圖：

1、CTV（割喉鱒病毒，一種新發(fā)病毒）

屬于海佩病毒科（Hepeviridae），為直徑25-35納米的小型球形病毒。（圖1）

2、IHNV（傳染性造血器官壞死病毒）

屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae），呈子彈形結(jié)構(gòu)，尺寸約為寬70納米、長170納米，主要感染虹鱒魚和紅鮭魚。（圖2）

3、ISAV（傳染性鮭魚貧血病毒）

屬于正黏液病毒科（Orthomyxoviridae），病毒粒子直徑通常為50-120納米。該病毒多發(fā)于養(yǎng)殖的大西洋鮭魚群體中，致死率極高（圖3）。

4、LMBV（大口黑鱸病毒）

屬于虹彩病毒科（Iridoviridae），呈二十面體結(jié)構(gòu)，直徑約150納米。目前主要分布于美國東南部的大口黑鱸種群中。（圖4）

      圖1               圖2                 圖3               圖4

我們希望在已知培養(yǎng)條件下快速檢測溶液中病毒顆粒的存在，并選擇動態(tài)光散射（DLS）來進(jìn)行探索。

1、實(shí)驗樣品由美國華盛頓州西雅圖市美國地質(zhì)調(diào)查局西部漁業(yè)研究中心（USGS Western Fisheries Research Center）友情提供。病毒顆粒在含有胎牛血清（FBS）的最低必需培養(yǎng)基（Minimum Essential Medium）中通過奇努克鮭魚胚胎細(xì)胞培養(yǎng)增殖，并釋放至培養(yǎng)基中。通過離心分離去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片后，含有病毒顆粒的培養(yǎng)基保存于5°C冷藏環(huán)境中備用。

2、動態(tài)光散射（DLS）測量使用布魯克海文儀器公司（Brookhaven Instruments）的ZetaPALS型號儀器，該儀器配置了BI-MAS粒度測量附件。

3、實(shí)驗前，樣品在25°C的樣品艙中平衡至少5分鐘，隨后在聚苯乙烯比色皿中于25°C條件下進(jìn)行測量。

4、DLS自相關(guān)數(shù)據(jù)通過NNLS反卷積算法處理，粒徑分布結(jié)果分別基于光強(qiáng)和數(shù)量分布進(jìn)行統(tǒng)計，最終數(shù)據(jù)導(dǎo)出為Excel格式，并利用Origin 8.0軟件繪圖。

非負(fù)最小二乘（NNLS）分布的統(tǒng)計權(quán)重可基于顆粒數(shù)量、表面積、體積或?qū)崪y散射光強(qiáng)進(jìn)行設(shè)定。其中，光強(qiáng)加權(quán)法會顯著放大溶液中大粒徑顆粒的權(quán)重，這是由于散射光強(qiáng)與粒徑呈冪次關(guān)系，如圖5所示；而數(shù)量加權(quán)法則更突出小粒徑顆粒的分布特征。

圖5

圖6

圖7

通過光強(qiáng)加權(quán)分布分析，結(jié)果明確顯示存在符合預(yù)期平均尺寸的病毒顆粒，圖6所示；但在數(shù)量分布中卻未檢測到這些顆粒，圖7所示。這表明病毒顆粒確實(shí)存在，但其數(shù)量相對培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)及其他小分子顯著稀少。此外，數(shù)據(jù)中還存在其他大粒徑顆粒信號，可能來源于未被完全去除的細(xì)胞碎片或表達(dá)分子（如RNA、蛋白質(zhì)）。這些物質(zhì)因與病毒顆粒尺寸相近，可能在離心步驟中未被有效分離。通過設(shè)置合理的對照樣本，可進(jìn)一步區(qū)分病毒顆粒與游離細(xì)胞碎片。