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通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒

來源:美國布魯克海文儀器公司   2025年06月06日 10:30  
通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒


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介紹

通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒
通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒

傳統(tǒng)的視覺方法觀察溶液中病毒顆粒只能獲取極小樣本量的瞬時圖像,而基于動態(tài)光散射的顆粒分析技術(shù)則能獲得溶液中顆粒粒徑的整體平均值。目前,如何準(zhǔn)確獲得實(shí)驗室培養(yǎng)病毒的顆粒粒徑數(shù)據(jù)是一項不小的挑戰(zhàn),因為他們必須在含有白蛋白和其他小分子蛋白(如胎牛血清FBS或最低必需培養(yǎng)基MEM中的成分)的細(xì)胞培養(yǎng)基中增殖。當(dāng)病毒顆粒從細(xì)胞中釋放出來時,體積較大的細(xì)胞碎片可通過離心分離,但培養(yǎng)基中的小分子蛋白質(zhì)無法被去除。通過精確選擇動態(tài)光散射實(shí)驗的分布參數(shù),即使在含有培養(yǎng)基中較小蛋白質(zhì)的背景下,仍能準(zhǔn)確分析出病毒顆粒的粒徑分布。



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背景

通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒
通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒

魚類病毒

許多魚類病毒有可能對觀賞和經(jīng)濟(jì)類魚類種群造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。本文將重點(diǎn)研究以下四種病毒類型,并附上各病毒科的典型結(jié)構(gòu)示意圖:

1、CTV(割喉鱒病毒,一種新發(fā)病毒)

屬于海佩病毒科(Hepeviridae),為直徑25-35納米的小型球形病毒。(圖1)


2、IHNV(傳染性造血器官壞死病毒)

屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae),呈子彈形結(jié)構(gòu),尺寸約為寬70納米、長170納米,主要感染虹鱒魚和紅鮭魚。(圖2)


3、ISAV(傳染性鮭魚貧血病毒)

屬于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae),病毒粒子直徑通常為50-120納米。該病毒多發(fā)于養(yǎng)殖的大西洋鮭魚群體中,致死率極高(圖3)。


4、LMBV(大口黑鱸病毒)

屬于虹彩病毒科(Iridoviridae),呈二十面體結(jié)構(gòu),直徑約150納米。目前主要分布于美國東南部的大口黑鱸種群中。(圖4)

通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒

      圖1               圖2                 圖3               圖4

我們希望在已知培養(yǎng)條件下快速檢測溶液中病毒顆粒的存在,并選擇動態(tài)光散射(DLS)來進(jìn)行探索。


動態(tài)光散射儀器:

通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒


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實(shí)驗方法

通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒
通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒

1、實(shí)驗樣品由美國華盛頓州西雅圖市美國地質(zhì)調(diào)查局西部漁業(yè)研究中心(USGS Western Fisheries Research Center)友情提供。病毒顆粒在含有胎牛血清(FBS)的最低必需培養(yǎng)基(Minimum Essential Medium)中通過奇努克鮭魚胚胎細(xì)胞培養(yǎng)增殖,并釋放至培養(yǎng)基中。通過離心分離去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片后,含有病毒顆粒的培養(yǎng)基保存于5°C冷藏環(huán)境中備用。


2、動態(tài)光散射(DLS)測量使用布魯克海文儀器公司(Brookhaven Instruments)的ZetaPALS型號儀器,該儀器配置了BI-MAS粒度測量附件。


3、實(shí)驗前,樣品在25°C的樣品艙中平衡至少5分鐘,隨后在聚苯乙烯比色皿中于25°C條件下進(jìn)行測量。


4、DLS自相關(guān)數(shù)據(jù)通過NNLS反卷積算法處理,粒徑分布結(jié)果分別基于光強(qiáng)和數(shù)量分布進(jìn)行統(tǒng)計,最終數(shù)據(jù)導(dǎo)出為Excel格式,并利用Origin 8.0軟件繪圖。


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數(shù)據(jù)分析

通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒
通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒

分布曲線

非負(fù)最小二乘(NNLS)分布的統(tǒng)計權(quán)重可基于顆粒數(shù)量、表面積、體積或?qū)崪y散射光強(qiáng)進(jìn)行設(shè)定。其中,光強(qiáng)加權(quán)法會顯著放大溶液中大粒徑顆粒的權(quán)重,這是由于散射光強(qiáng)與粒徑呈冪次關(guān)系,如圖5所示;而數(shù)量加權(quán)法則更突出小粒徑顆粒的分布特征。

通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒

圖5


通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒

圖6


通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒

圖7


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結(jié)果與討論

通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒
通過動態(tài)光散射分析培養(yǎng)基中的病毒顆粒

通過光強(qiáng)加權(quán)分布分析,結(jié)果明確顯示存在符合預(yù)期平均尺寸的病毒顆粒,圖6所示;但在數(shù)量分布中卻未檢測到這些顆粒,圖7所示。這表明病毒顆粒確實(shí)存在,但其數(shù)量相對培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)及其他小分子顯著稀少。此外,數(shù)據(jù)中還存在其他大粒徑顆粒信號,可能來源于未被完全去除的細(xì)胞碎片或表達(dá)分子(如RNA、蛋白質(zhì))。這些物質(zhì)因與病毒顆粒尺寸相近,可能在離心步驟中未被有效分離。通過設(shè)置合理的對照樣本,可進(jìn)一步區(qū)分病毒顆粒與游離細(xì)胞碎片。


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