一、細(xì)胞簡(jiǎn)介

平臺(tái)編號(hào)：Bio-73445

規(guī)格：1×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

細(xì)胞信息：C6/36

細(xì)胞名稱(chēng)：C6/36（蚊子細(xì)胞）

種屬：蚊子

年齡（性別）：幼蟲(chóng)

生長(zhǎng)特性：貼壁

生長(zhǎng)培養(yǎng)基：MEM＋10% FBS＋1% P/S

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5% 溫度：28℃

用途：研究

注意事項(xiàng)：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類(lèi)或動(dòng)物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫(kù)為準(zhǔn)）

二、產(chǎn)品特點(diǎn)

特點(diǎn)：細(xì)胞代數(shù)為4-5代左右

包裝：內(nèi)層無(wú)菌自封袋；專(zhuān)用防壓泡沫盒；外層防壓保溫氣泡袋；說(shuō)明書(shū)

細(xì)胞來(lái)源：ATCC、sciencell、ICLC

貨期：1-2周

運(yùn)輸方式：快遞運(yùn)輸

形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

三、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇

實(shí)驗(yàn)方法原理

細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

四、操作流程

（一）材料準(zhǔn)備

1、儀器：凈化工作臺(tái)、 離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

2、玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、 培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。

3、塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。

4、其他物品：微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。

5、試劑：D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無(wú)色新鮮甘油。

（二）蚊子細(xì)胞C6/36系細(xì)胞凍存

1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。

2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中。

3、離心1 000 rpm，5 min。

4、去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。

5、將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。

6、在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱(chēng)，凍存時(shí)間及操作者。

7、凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

（三）細(xì)胞復(fù)蘇

1、從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。

2、從37℃水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。

3、離心， 1 000 rpm，5 min。

4、棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

5、次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

五、適用范圍

1、從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。

2、將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷。

3、凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液。

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