Southern Blot原理及實驗方法    SDS-PAGE實驗原理:

   聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 (簡稱Acr) 和交聯(lián)劑N，N’—亞甲基雙丙烯酰胺（簡稱Bis）在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進行電泳。 

人乳腺癌細胞，Hs 578T細胞  
人乳腺癌細胞，MDA-MB-468-06細胞 
聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。

人胚肺二倍體細胞，2BS細胞（T25培養(yǎng)瓶@密度75%） 
人支氣管上皮樣細胞，BEAS-2B細胞
SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復合物，使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。

人典型小細胞肺癌細胞，NCI-H1688細胞（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
人非小細胞肺癌細胞，NCI-H1299細胞（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）

因此，各種蛋白質(zhì)-SDS 復合物在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDS—PAGE）。

人肺腺癌細胞 SPC-A1細胞 規(guī)格（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
人肺癌細胞 A549細胞 規(guī)格（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
由于SDS-PAGE 可設(shè)法將電泳時蛋白質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計的程度，因此常用來鑒定蛋白質(zhì)分離樣品的純化程度，如果被鑒定的蛋白質(zhì)樣品很純，只含有一種具三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或含有相同分子量亞基的具四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，那么SDS—PAGE 后，就只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。

人肺癌細胞 TKB-1細胞 規(guī)格（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
人肺腺癌細胞，LTEP-a-2細胞 規(guī)格（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
SDS—PAGE 可分為圓盤狀和垂直板狀、連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)。本實驗采用垂直板狀不連續(xù)系統(tǒng)。所謂“不連續(xù)”是指電泳體系由兩種或兩種以上的緩沖液、pH 和凝膠孔徑等所組成。

人非小細胞肺癌細胞 H125細胞 規(guī)格（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
人肺癌細胞 H1299細胞 規(guī)格（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）

樣品的濃縮效應(yīng)：在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，含有上、下槽緩沖液(Tris—Gly，pH8.3)、濃縮膠緩沖液(Tris—HCl，pH6.8)、分離膠緩沖液(Tris—HCl，pH8.8)，兩種凝膠的濃度(即孔徑)也不相同。
在這種條件下，緩沖系統(tǒng)中的HCl 幾乎全部解離成Cl－，兩槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解離成Gly 的負離子，而酸性蛋白質(zhì)也可解離出負離子。這些離子在電泳時都向正極移動。
C1—速度zui快(先導離子)，其次為蛋白質(zhì)，Gly 負離子zui慢(尾隨離子)。

人肺腺癌細胞，Lu-165細胞 規(guī)格（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
人大細胞肺癌細胞，NCI-H460細胞 規(guī)格（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
由于C1—很快超過蛋白離子，因此在其后面形成一個電導較低、電位梯度較陡的區(qū)域，該區(qū)電位梯度zui高，這是在電泳過程中形成的電位梯度的不連續(xù)性，導致蛋白質(zhì)和Gly 離子加快移動，結(jié)果使蛋白質(zhì)在進入分離膠之前，快、慢離子之間濃縮成一薄層，有利于提高電泳的分辨率。

人肺腺癌細胞，SPC-A-1細胞 規(guī)格（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞，095-D細胞（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）

分子篩效應(yīng)：蛋白質(zhì)離子進入分離膠后，條件有很大變化。由于其pH 升高(電泳進行時常超過9.0)，使Gly 解離成負離子的效應(yīng)增加；同時因凝膠的濃度升高，蛋白質(zhì)的泳動受到影響，遷移率急劇下降。

人肺鱗癌細胞，SK-MES-1細胞（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
人大細胞肺癌細胞，NCI-H661細胞（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
人肺黏液上皮樣癌細胞，NCI-H292細胞 
此兩項變化，使Gly 的移動超過蛋白質(zhì)，上述的高電壓梯度不復存在，蛋白質(zhì)便在一個較均一的pH 和電壓梯度環(huán)境中，按其分子的大小移動。
分離膠的孔徑有一定的大小，對不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)來說，通過時受到的阻滯程度不同，即使凈電荷相等的顆粒，也會由于這種分子篩的效應(yīng)，把不同大小的蛋白質(zhì)相互分開。

人肺退行性癌細胞，Calu-6細胞（T25培養(yǎng)瓶@密度75%） 
人肺腺癌細胞，NCI-H1395細胞（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）
人非小細胞肺癌細胞，NCI-H358細胞（T25培養(yǎng)瓶@密度75%
人非小細胞肺癌細胞，HCC827細胞（T25培養(yǎng)瓶@密度75%）

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