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非小細胞肺癌細胞 HCC827細胞

來源:通派(上海)生物科技有限公司   2015年12月10日 09:38  

Southern Blot原理及實驗方法    SDS-PAGE實驗原理:

   聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 (簡稱Acr) 和交聯(lián)劑N,N’—亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在催化劑作用下,聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠,并以此為支持物進行電泳。 

人乳腺癌細胞,Hs 578T細胞  
人乳腺癌細胞,MDA-MB-468-06細胞 
聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶,如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)樣品電泳后,就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。

人胚肺二倍體細胞,2BS細胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%) 
人支氣管上皮樣細胞,BEAS-2B細胞
SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵,并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復合物,使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷,掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。

人典型小細胞肺癌細胞,NCI-H1688細胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
人非小細胞肺癌細胞,NCI-H1299細胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)

因此,各種蛋白質(zhì)-SDS 復合物在電泳時的遷移率,不再受原有電荷和分子形狀的影響,而只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS—PAGE)。

人肺腺癌細胞 SPC-A1細胞 規(guī)格(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
人肺癌細胞 A549細胞 規(guī)格(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
由于SDS-PAGE 可設(shè)法將電泳時蛋白質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計的程度,因此常用來鑒定蛋白質(zhì)分離樣品的純化程度,如果被鑒定的蛋白質(zhì)樣品很純,只含有一種具三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或含有相同分子量亞基的具四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),那么SDS—PAGE 后,就只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。

人肺癌細胞 TKB-1細胞 規(guī)格(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
人肺腺癌細胞,LTEP-a-2細胞 規(guī)格(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
SDS—PAGE 可分為圓盤狀和垂直板狀、連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)。本實驗采用垂直板狀不連續(xù)系統(tǒng)。所謂“不連續(xù)”是指電泳體系由兩種或兩種以上的緩沖液、pH 和凝膠孔徑等所組成。

人非小細胞肺癌細胞 H125細胞 規(guī)格(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
人肺癌細胞 H1299細胞 規(guī)格(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)

樣品的濃縮效應(yīng):在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中,含有上、下槽緩沖液(Tris—Gly,pH8.3)、濃縮膠緩沖液(Tris—HCl,pH6.8)、分離膠緩沖液(Tris—HCl,pH8.8),兩種凝膠的濃度(即孔徑)也不相同。
在這種條件下,緩沖系統(tǒng)中的HCl 幾乎全部解離成Cl-,兩槽中的Gly (pI=6.0,pK a=9.7)只有很少部分解離成Gly 的負離子,而酸性蛋白質(zhì)也可解離出負離子。這些離子在電泳時都向正極移動。
C1—速度zui快(先導離子),其次為蛋白質(zhì),Gly 負離子zui慢(尾隨離子)。

人肺腺癌細胞,Lu-165細胞 規(guī)格(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
人大細胞肺癌細胞,NCI-H460細胞 規(guī)格(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
由于C1—很快超過蛋白離子,因此在其后面形成一個電導較低、電位梯度較陡的區(qū)域,該區(qū)電位梯度zui高,這是在電泳過程中形成的電位梯度的不連續(xù)性,導致蛋白質(zhì)和Gly 離子加快移動,結(jié)果使蛋白質(zhì)在進入分離膠之前,快、慢離子之間濃縮成一薄層,有利于提高電泳的分辨率。

人肺腺癌細胞,SPC-A-1細胞 規(guī)格(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞,095-D細胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)

分子篩效應(yīng):蛋白質(zhì)離子進入分離膠后,條件有很大變化。由于其pH 升高(電泳進行時常超過9.0),使Gly 解離成負離子的效應(yīng)增加;同時因凝膠的濃度升高,蛋白質(zhì)的泳動受到影響,遷移率急劇下降。

人肺鱗癌細胞,SK-MES-1細胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
人大細胞肺癌細胞,NCI-H661細胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
人肺黏液上皮樣癌細胞,NCI-H292細胞 
此兩項變化,使Gly 的移動超過蛋白質(zhì),上述的高電壓梯度不復存在,蛋白質(zhì)便在一個較均一的pH 和電壓梯度環(huán)境中,按其分子的大小移動。
分離膠的孔徑有一定的大小,對不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)來說,通過時受到的阻滯程度不同,即使凈電荷相等的顆粒,也會由于這種分子篩的效應(yīng),把不同大小的蛋白質(zhì)相互分開。

人肺退行性癌細胞,Calu-6細胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%) 
人肺腺癌細胞,NCI-H1395細胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)
人非小細胞肺癌細胞,NCI-H358細胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%
人非小細胞肺癌細胞,HCC827細胞(T25培養(yǎng)瓶@密度75%)

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