豬雪旺氏原代細(xì)胞

豬雪旺氏細(xì)胞分離組織；周?chē)到y(tǒng)中的膠質(zhì)細(xì)胞稱(chēng)施萬(wàn)（schwann，又名雪旺細(xì)胞）細(xì)胞，它沿元的突起分布。施萬(wàn)細(xì)胞包裹在纖維上，這種纖維叫有髓纖維。有髓纖維和無(wú)髓纖維的施萬(wàn)細(xì)胞的形態(tài)和功能有所差異，施萬(wàn)細(xì)胞的外表面有基膜，能分泌營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)受損的元的存活及其軸突的再生，參與周?chē)到y(tǒng)中纖維的構(gòu)成。施萬(wàn)細(xì)胞的胞核呈長(zhǎng)卵圓形，其長(zhǎng)軸與軸突平行，核周有少量胞質(zhì)。由于施萬(wàn)細(xì)胞包在軸突的外面，故又稱(chēng)膜細(xì)胞（neurilemmalcell），它的外面包有一層基膜。施萬(wàn)細(xì)胞外面的一層胞膜與基膜一起往往又稱(chēng)膜（neurilemma），光鏡下可見(jiàn)此膜。在有髓纖維發(fā)生中，伴隨軸突一起生長(zhǎng)的施萬(wàn)細(xì)胞表面凹陷成一縱溝，軸突位于縱溝內(nèi)，溝緣的胞膜相貼形成軸突系膜（mesaxon）。軸突系膜不斷伸長(zhǎng)并反復(fù)包卷軸突，把胞質(zhì)擠至細(xì)胞的內(nèi)、外邊緣及兩端（即靠近郎氏結(jié)處），從而形成許多同心圓的螺旋膜板層，即為髓鞘。故髓鞘乃成自施萬(wàn)細(xì)胞的胞膜，屬施萬(wàn)細(xì)胞的一部分。施萬(wàn)細(xì)胞的胞質(zhì)除見(jiàn)于細(xì)胞的外、內(nèi)邊緣和兩端外，還見(jiàn)于髓鞘板層內(nèi)的施－蘭切跡。該切跡構(gòu)成螺旋形的胞質(zhì)通道，并與細(xì)胞外、內(nèi)邊緣的胞質(zhì)相通。

產(chǎn)品名稱(chēng)：豬雪旺氏細(xì)胞

組織來(lái)源：神經(jīng)

產(chǎn)品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

培養(yǎng)基：含FBS、bFGF、Insulin、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：雙極、多極形

傳代特性：可傳1-2代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

豬雪旺氏細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專(zhuān)用生長(zhǎng)培養(yǎng)基及正確的操作方法來(lái)培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

方法簡(jiǎn)介

實(shí)驗(yàn)室分離的豬雪旺氏采用 - 膠原酶混合消化法制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室分離的豬雪旺氏經(jīng)S-100免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類(lèi)；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細(xì)胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。