3D多能干細胞：更簡單的培養(yǎng)、更仿真的分化技術(shù)
引言
制備擬胚體
多能性驗證
大限度提高分化效率
結(jié)論
材料
參考文獻

引言
本書論述了在多能干細胞（PSC）來源的胚胎發(fā)育與分化的生產(chǎn)過程中進行三維（3D）細胞培養(yǎng)的重要性。本文包含了擬胚體（EB）技術(shù)的概述，并就生成擬胚體的不同技術(shù)進行了比較。同時，也針對驗證新建立PSC細胞系多能性的應(yīng)用，對畸胎瘤分析與EB技術(shù)進行了比較和討論。

3D多能干細胞：更簡單的培養(yǎng)、更仿真的分化技術(shù)

引言

制備擬胚體

多能性驗證

大限度提高分化效率

結(jié)論

材料

參考文獻

 

引言

本書論述了在多能干細胞（PSC）來源的胚胎發(fā)育與分化的生產(chǎn)過程中進行三維（3D）細胞培養(yǎng)的重要性。本文包含了擬胚體（EB）技術(shù)的概述，并就生成擬胚體的不同技術(shù)進行了比較。同時，也針對驗證新建立PSC細胞系多能性的應(yīng)用，對畸胎瘤分析與EB技術(shù)進行了比較和討論。后，本文還對近通過3D培養(yǎng)來提升分化效率的文獻進行了一個簡短的描述。

制備擬胚體

擬胚體（EB）是PSC的三維聚集物，可以重現(xiàn)胚胎的結(jié)構(gòu)，這也意味著其中包含了完整的三個胚層：外胚層、內(nèi)胚層和中胚層）。EB分化的初始階段與植入后早期胚胎的分化過程極其相似¹。EB當(dāng)中先分化的細胞類型為原始內(nèi)胚層的外層，這也是分泌出基底膜的一層細胞。

分泌出來的胞外基質(zhì)包裹著內(nèi)部的原始外胚層細胞，相當(dāng)于胚胎的外胚層。未與基底膜接觸的原始外胚層細胞會發(fā)生凋亡現(xiàn)象，進而形成一個囊狀結(jié)構(gòu)。在胚胎中，胚外信號中心在外胚層形成了一個精確的原條位點（這也是原腸的起始位點），進而形成中胚層與內(nèi)胚層。然而， EB缺少胚外信號中心，因此相比胚胎而言，EB原始外胚層向中胚層與內(nèi)胚層的分化過程顯得混亂和缺乏組織性。兩個研究組提出，EB比之前的猜想更有組織性；如果在正確的時間給予正確的信號，它們的組織性會得到極大提升，進而形成與正常胚胎發(fā)育十分相近的過程，其中也包括了原腸胚的形成過程^{2, 3}。這些特性使得EB成為了一個*的模式系統(tǒng)，通過這一系統(tǒng)，可在一個原來難以介入的時間點研究各類胚胎發(fā)育過程，特別在人源細胞研究中尤其重要。^{4, 5}.

目前可通過多種方法來制備EB，部分方法如圖1所示。這些方法重要的特點是能夠抑制PSC的表面貼壁效應(yīng)，促使它們通過依賴E-鈣粘著蛋白的粘附通路相互粘連起來。

圖1 部分制備擬胚體的方法。圖片源自⁶。

 

培養(yǎng)皿（靜止）、旋轉(zhuǎn)瓶和低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)容器等懸浮培養(yǎng)裝置易于設(shè)置和維護，但會形成不同大小的EB，并聚集成各類形狀的團塊（圖2）。EB大小增加會降低質(zhì)量傳輸速率⁷。不僅如此，業(yè)界普遍認為EB大小和形狀的改變還會改變分化模式⁸。此外，一旦原始內(nèi)胚層開始分泌胞外基質(zhì)，EB就將開始隨機貼壁（即使是培養(yǎng)皿的疏水表面），這會導(dǎo)致貼壁與懸浮EB的細胞系出現(xiàn)巨大的特性差異。使用旋轉(zhuǎn)瓶與低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)容器可減少聚集現(xiàn)象，并避免之前所提到的貼壁現(xiàn)象，不過使用這類培養(yǎng)容器需要在懸浮與剪切力造成的細胞損傷之間找到平衡點⁹。強制聚集培養(yǎng)技術(shù) - 使用圓底低粘附平板、離心管和工程改造的微孔培養(yǎng)皿（圖1中未展示）等容器 - 用戶可通過測定每孔中加入的細胞數(shù)目，精確控制EB的大小。

圖2 培養(yǎng)于低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)容器（A），懸滴培養(yǎng)（B）和在細菌培養(yǎng)皿中靜態(tài)懸浮培養(yǎng)（C）的EB圖片。請注意懸滴培養(yǎng)的EB在尺寸與形狀上都獲得了的均一度。圖片源自⁹。比例標尺 = 500 μM

 

在微孔和試管中強制聚集培養(yǎng)的缺點之一是，通過剛性的人造塑料界面人為地決定和限制了EB的形狀，進而可能影響分化過程¹⁰。同時，從小孔和試管中取出EB而不影響到它們的結(jié)構(gòu)，操作起來也很有難度。圖1所示的優(yōu)勢的方法為懸滴培養(yǎng)。種植細胞的數(shù)量可控制懸滴EB的大小，EB的形狀也不會受到任何人工塑料基質(zhì)表面的限制。過去建立這些培養(yǎng)體系十分費時費力，因為您需要在平板的蓋子上制備懸液再反轉(zhuǎn)形成懸滴。為了給EB提供營養(yǎng)，研究人員需要將它們轉(zhuǎn)移至另一個組織培養(yǎng)容器中，通常是細菌培養(yǎng)皿或低粘附力的培養(yǎng)皿中。

Perfecta3D^® 懸滴培養(yǎng)平板大幅改善了EB制備與培養(yǎng)流程。用戶只需在每個小孔的上方加入一滴細胞懸液，孔板的幾何構(gòu)造就會引導(dǎo)細胞和培養(yǎng)基通過一個小洞，進而形成一個穩(wěn)定的懸滴。滴入口位于每個培養(yǎng)孔的上方，可用來更換培養(yǎng)基，添加外源胞外基質(zhì)、生長因子、小分子，也可用來加入細胞形成混合培養(yǎng)物。所有這些選項都為EB的分化操作帶來了極大的便利性與可控性。能方便地為培養(yǎng)物添加養(yǎng)分，意味著懸滴培養(yǎng)物可避免EB聚集或粘附在培養(yǎng)皿底部，從而使培養(yǎng)時間顯著延長。

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細胞多能性驗證

當(dāng)全新的PSC細胞系建立時，用戶需對其進行評估，以確認其真實擁有多能性。對于人源PSC細胞系而言，傳統(tǒng)的驗證方法是包括體外的多能基因表達水平驗證、表觀遺傳分析和EB形成分析，以及體內(nèi)的畸胎瘤分析等（圖3）。應(yīng)用于小鼠PSC細胞系更嚴格的多能性檢測方法，包括四倍體互補實驗^{11, 12} 及宿主胚泡注射實驗^{13, 14}, 都不適用于人PSC細胞系。一些科學(xué)家堅持認為畸胎瘤分析是驗證人PSC多能性的檢測法，是確定新細胞系多能性的必要手段。不過，業(yè)界對于畸胎瘤分析所采用的方法存在極大的分歧，都希望建立更為*的標準實驗步驟，從而對新建立的PSC細胞系之間進行結(jié)果比較¹⁵。

圖3 在腎囊下注射PSC所形成的整個畸胎瘤（A）。對包含中胚層（B，C），內(nèi)胚層（D）和外胚層（E，F(xiàn)）的組織切片進行蘇木精與曙紅染色分析。圖像源自¹⁶。比例標尺 = 100 μM

誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)系的制備成功率遠遠高過胚胎干細胞系，當(dāng)畸胎瘤分析被認為十分關(guān)鍵時，該分析就更加顯得費力、昂貴和耗時，也需要大量的實驗動物。因此，如果畸胎瘤分析對于證明多能性的作用不可替代，或一組體外檢測就已足夠，那么在此之前對幾個蛋白因子進行檢測就顯得十分重要了。

標準化的體外 EB形成操作可獲得大小和數(shù)目*的細胞，如果和定量細胞譜系分析方法聯(lián)用，在許多情況下可作為畸胎瘤檢測的有效替代手段（圖4）¹⁷。例如，由于iPSC的生物學(xué)與功能仍處于謹慎研究階段，許多實驗室正在針對人類疾病模型建立多能細胞系。作為疾病模型的實驗室細胞系基本無需確定致瘤性，因此進行畸胎瘤分析就是浪費時間和資源¹⁸。iPSC能否制備出更優(yōu)良的模型至今仍存在頗多爭議，這已超出了此書的論述范圍^19-21。此外，如果特定細胞類型/組織的胚胎發(fā)育過程已得到充分的研究，人們即可通過定向3D分化（請見下一節(jié)）來評估新建立PSC細胞系參與“正常”發(fā)育模型的能力，這是在畸胎瘤檢測或自然EB分化操作中無法實現(xiàn)的²²。

 

圖4 使用蘇木精和曙紅對EB切片進行染色，呈現(xiàn)外胚層（A）、中胚層（B）和內(nèi)胚層（C）的分化。圖像源自¹⁷。!!比例標尺 = 50 μM。

 

大限度提高分化效率

部分細胞類型和組織需3D培養(yǎng)才能實現(xiàn)PSC的大分化效率。胚胎發(fā)育不會發(fā)生在單層細胞，無數(shù)的研究案例說明了某一胚層的胞外信號如何影響相鄰胚層的特性。例如，心臟特性只會出現(xiàn)在那些暴露于前內(nèi)胚層（所分泌）信號的中胚層細胞中²³。實際上，相對于2D培養(yǎng)，人類PSC細胞的心臟分化在3D培養(yǎng)條件下效果更好。這很可能是因為3D培養(yǎng)時信號轉(zhuǎn)導(dǎo)更接近生理狀態(tài)，存在PSC源心臟支持細胞，同時存在更天然的心肌三維整體結(jié)構(gòu)^{24, 25}。在胚胎發(fā)育過程中，一些外胚層表面區(qū)域會變厚，隨后發(fā)育為感覺器官部分，如眼（光基板）和耳（耳基板）。這些區(qū)域的分化也需要二維培養(yǎng)條件無法方便形成的多層細胞結(jié)構(gòu)。胚胎發(fā)生的復(fù)雜分化模式在3D培養(yǎng)條件下不會受限，因此在體外可能獲得更好的重復(fù)性。實際上，已有一些案例證明感覺基板擁有令人驚訝的自組織（self-patterned）分化過程：可從精確激活的EB分化為內(nèi)耳毛細胞（圖5）和視網(wǎng)膜色素化表皮細胞^26-28。

圖5 示意簡圖展示了PSC 3D分化為聽覺基板進而形成感覺上皮的過程。圖像源自²⁸。

 

結(jié)論

在3D環(huán)境下培養(yǎng)PSC擁有巨大的優(yōu)勢，不僅可以有效驗證新建立細胞系的多能性，還能大限度達到實際的細胞分化效果。誘導(dǎo)天然EB分化且避免人為干擾的整體性方法是懸滴培養(yǎng)技術(shù)，目前3D Biomatrix公司的Perfecta3D的懸滴培養(yǎng)平板可幫助用戶方便地實現(xiàn)這一操作。用戶可以靈活添加試劑、小分子、胞外基質(zhì)、額外的細胞和營養(yǎng)物質(zhì)，同時可以維持懸滴狀態(tài)，從而為創(chuàng)新和改良PSC分化方法提供了更多空間。如需了解關(guān)于3D培養(yǎng)的更多信息，請參見我們的3D細胞培養(yǎng)知識中心（3D Culture Knowledge Center）： http://3dbiomatrix.com/knowledge-center。
 

材料

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參考文獻

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