實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用；實時熒光定量PCR：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，Z后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR（Real Time Quantitative PCR）

在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。相對定量用于測定一個測試樣本中目標核酸序列與校正樣本中同一序列表達的相對變化。校正樣本可以是一個未經(jīng)處理的對照或者是在一個時辰研究中處于零時的樣本。

相對定量應用（Relative Quantification，RQ）

非特異性熒光標記：

1、SYBR Green

   SYBR Green特性：

（1）只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光。

（2）變性時，DNA雙鏈分開，無熒光。

（3）在延伸結束階段采集熒光信號。

（4）SYBR Green也能和非特異性的雙鏈DNA結合發(fā)光，所以必須在反應結束時做熔解曲線分析。

相對定量通過內(nèi)標定量：
內(nèi)標（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因，在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小，內(nèi)標定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量。

 

相對定量分析方法：

2-ΔΔCt
前提：目標序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)
  1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標基因的CT值：
    ΔCT（test）= CT（target,test）-CT（ref,test） 
    ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）-CT（ref, calibrator） 
  2、用校準樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值：
         ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
  3、計算表達水平比率：
                    2 –ΔΔCT=表達量的比值

服務流程：

步驟	客 戶 提 供	服 務 內(nèi) 容	基 屹 提 供
1	新鮮的且盡量多的材料；已知的全長基因序列；盡可能詳細的背景資料：DNA/ RNA來源、豐度等。	DNA/RNA提取，根據(jù)基因序列設計特異性的引物和熒光探針。
2	純化好的DNA/RNA（大于5 ug/樣品）；已知的全長基因序列；盡可能詳細的背景資料：DNA/ RNA來源、豐度等。	根據(jù)基因序列設計特異性的引物和熒光探針。
3		以DNA為模板，對目的基因進行熒光定量PCR檢測分析	提供完整的定量分析結果、實驗熒光定量擴增曲線及詳細的實驗步驟。

注意：客戶可根據(jù)所能提供的起始材料不同，選擇從步驟1或2啟動項目。