一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1. ?樣本處理?

• 需取大鼠心臟組織，去除周圍血管和結(jié)締組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后石蠟包埋或OCT包埋冷凍切片58

• 新生大鼠心臟需用D-Hanks液沖洗殘留血細(xì)胞，組織塊消化采用0.08%蛋白酶分次消化4

2. ?主要試劑與儀器?

• 一抗（如心鈉素抗體、Col Ⅰ/Ⅲ抗體）、二抗、DAB顯色試劑

• 需準(zhǔn)備CO?培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、離心機(jī)等設(shè)備

二、實(shí)驗(yàn)操作流程

1. ?切片制備?

• 石蠟切片厚度建議5μm，需經(jīng)脫蠟、水化及抗原修復(fù)處理

• 冷凍切片需避免反復(fù)凍融，厚度通常為8-10μm

2. ?免疫染色?

• 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（3% H?O?）

• 血清封閉后滴加一抗（4℃過夜）

• 二抗孵育及DAB顯色

• 采用ABC法或PAP法，步驟包括：

• 熒光染色需避光操作，常用熒光二抗標(biāo)記

3. ?對照設(shè)置?

• 需設(shè)陰性對照（PBS替代一抗）和陽性對照（已知陽性組織）

三、結(jié)果分析

1. ?顯微鏡觀察?

• 心鈉素陽性顆粒主要分布于心房肌細(xì)胞胞質(zhì)，右心耳表達(dá)

• 膠原纖維（Col Ⅰ/Ⅲ）可通過Masson染色輔助評估纖維化程度

2. ?圖像處理?

• 使用圖像分析軟件定量陽性信號面積或光密度值

四、注意事項(xiàng)

• 組織固定時(shí)間不超過24小時(shí)，避免抗原丟失

• 蛋白酶消化新生心肌細(xì)胞時(shí)需嚴(yán)格控制時(shí)間（第一次8分鐘，后續(xù)2分鐘/次）

• 力竭運(yùn)動模型可能影響心鈉素表達(dá)，需規(guī)范動物分組

如需特定蛋白（如P物質(zhì)、心房肽）的檢測方法，可進(jìn)一步結(jié)合熒光染色或乙醛酸誘發(fā)熒光法