產(chǎn)品描述

支原體是最小的原核生物，其大小介于細菌和病毒之間，約為0.1~0.3μm，且具有變形能力，可透過常見過濾膜（0.22~0.45μm），因此常規(guī)的無菌過濾方法不能將其去除；無細胞壁結(jié)構(gòu)的特點，常規(guī)抗生素對其生長無法起到抑制作用；支原體在生長過程中是依靠宿主提供營養(yǎng)，吸附在細胞表面或之間，即為細胞污染物中最為主要的污染。由于支原體會使宿主細胞的代謝發(fā)生變化，進而導致細胞生長緩慢、分化和衰老

 Mycoplasma PCR Detection Kit

支原體PCR檢測試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品優(yōu)勢

●高廣譜性，可檢測所有可能含有支原體的樣品

●高靈敏度，可檢測低至10 copies的支原體

●高特異性，真核生物、細菌的基因組不會被檢測

●高保真性，本試劑盒含有陽標和陰標，可有效避免PCR反應(yīng)假陰性和假陽性

●操作簡易，本試劑盒的預(yù)混體系包含PCR反應(yīng)所需試劑

●耗時短，本試劑盒能夠在2小時內(nèi)完成支原體檢測

產(chǎn)品用途  《支原體PCR檢測試劑盒》可用于檢測所有可能含有支原體污染的樣品，例如：細胞培養(yǎng)的上清；血清；基礎(chǔ)培養(yǎng)基；體液樣品；其他樣品。

產(chǎn)品描述

支原體是最小的原核生物，其大小介于細菌和病毒之間，約為0.1~0.3μm，且具有變形能力，可透過常見過濾膜（0.22~0.45μm），因此常規(guī)的無菌過濾方法不能將其去除；無細胞壁結(jié)構(gòu)的特點，常規(guī)抗生素對其生長無法起到抑制作用；支原體在生長過程中是依靠宿主提供營養(yǎng)，吸附在細胞表面或之間，即為細胞污染物中最為主要的污染。由于支原體會使宿主細胞的代謝發(fā)生變化，進而導致細胞生長緩慢、分化和衰老死亡等現(xiàn)象，所以支原體污染檢測是細胞制劑品或細胞科研的基礎(chǔ)檢測。支原體PCR檢測試劑盒是優(yōu)選直擴式PCR酶擴增支原體基因組中保守16SrDNA而設(shè)計的，不會擴增細菌等其他基因組，兼具特異性和高靈敏性的特點，且本試劑盒檢測范圍廣，可檢測：(1)M.Hyorhinis，(2)M.Fermentans，(3)M.Arginini，(4)M. hominis，(5)M. orale，(6)M. salivarium，(7)M.pirum，(8)Acholeplasma Laidlawii，(9)M. agalactiae，(10)M.bovis，(11)M. buccale，(12)M. arthritidis，(13)M.pulmonis等幾乎所有常見的污染細胞的支原體(注：M.為Mycoplasma的縮寫)。以上13種支原體約占細胞支原體污染的99%以上。絕大多數(shù)支原體污染集中于前8種。因此非常適合于與細胞生物學相關(guān)的科研實驗室及企業(yè)的日常支原體檢測。
質(zhì)量控制     通過細菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測。

R R        通過滲透壓、pH 檢測。

R R        通過產(chǎn)品性能檢測。

使用方法

1.樣品準備

1.1 收集細胞培養(yǎng)液1mL，1000rpm離心5min。

1.2 緩慢吸取950µL上清液，13000rpm離心5min。

1.3 棄上清液。緩慢操作，請勿倒置或吸取離心管底部。
注：為增大檢測靈敏度或減少培養(yǎng)液中的成分對PCR反應(yīng)的抑制情況，可選擇使用PBS清洗1至2次，13000rpm離心5min，棄上清。

1.4 加入50µL ddH 2 O，混勻后，即為待測樣品；若當日不進行檢測，95℃加熱5min，存放于-20℃保存。

2.實驗環(huán)境消除支原體

2.1 使用75%酒精對所需實驗器材進行擦拭消毒。

2.2 使用去除支原體噴霧進行去除支原體，去假陽性污染源。

2.3 紫外照射30min，通風后方可使用。

3.樣品檢測

3.1 分別吸取20µL預(yù)混液（PCR Master Mix，含染料，藍色液體）至0.2mL PCR管中，緩慢加入，防止氣泡產(chǎn)生。

3.2 將待檢測樣品和陽標（PCR Positive，紫蓋管）及陰標（PCR Negative，白蓋管）分別按需加入預(yù)混體系進行支原體檢測。

注：操作時產(chǎn)生的微量氣溶膠即可造成樣品之間的相互污染，因此須小心謹慎，避免劇烈操作，為避免陽標污染，應(yīng)最后添加含陽標各組。

3.3 建議檢測體系如下：

注：預(yù)混體系為反應(yīng)優(yōu)化的體系，包含PCR所需的所有試劑，并已添加染料（藍色），反應(yīng)后可直接進行電泳檢測。待檢測樣+陽標反應(yīng)管能夠反映是否PCR反應(yīng)會被抑制。建議檢測時設(shè)置復(fù)孔，復(fù)孔管是為了提高檢測的準確性。

3.4添加所有待檢測樣品后，振蕩器上混勻，瞬時離心，即可進行PCR擴增，反應(yīng)程序如下：

注：反應(yīng)循環(huán)盡量不要超過35個，過多的循環(huán)數(shù)會造成假陽性或雜帶?；驁?zhí)行TOUCHDOWN-PCR程序，如下：

4.PCR產(chǎn)物檢測

4.1 配制1.5%瓊脂糖凝膠，加熱后加入適量GELRED用于紫外燈下顯色。

4.2 吸取5µL PCR反應(yīng)后的樣品進行上樣，DNA marker上樣量為5µL。

4.3 電泳條件：電壓為120V，20min左右（可以根據(jù)實際情況進行時間調(diào)整）。

4.4 電泳結(jié)束后，置于凝膠成像儀上拍照并保存結(jié)果。

5.結(jié)果分析

本試劑盒中的陽標大小為700 bp。支原體陽性的PCR擴增大小為500 bp左右。下圖為使用本試劑盒進行檢測的結(jié)果：

運輸與保存方法

干冰運輸。-20℃ 儲存，有效期為12個月。請合理分裝，避免反復(fù)凍融。

特別提醒

? 使用本試劑前請仔細閱讀說明書；

? 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究使用，不得用于臨床診斷；

? 待細胞培養(yǎng)2~3天后，細胞生長至80%匯合度（貼壁細胞）或密度達到10 6 /mL（懸浮細胞）時取樣進行檢測；

? 預(yù)混體系應(yīng)該在使用前化凍，瞬時離心后，輕彈混勻；

? 在已滅菌的PCR管中配制反應(yīng)體系，每次實驗均需至少加一個陰性和一個陽性對照，測試反應(yīng)管建議設(shè)置平行對照；

? 應(yīng)該在專屬區(qū)域進行檢測，避免交叉污染；

? 配制過程中應(yīng)注意無菌，戴口罩，并注意避免操作產(chǎn)生的氣溶膠造成樣品間的交叉污染，推薦在生物安全柜中進行操作；

? 加液時槍頭最好貼著管壁，所有管子用完即蓋，需添加陽標的各組留在最后，取過樣品的槍頭用完即棄，盡量減少操作時污染的可能性；

? 當PCR反應(yīng)被強抑制時（即樣品+陽標體系無法獲得陽標條帶），建議使用PBS清洗，同時補加2%BSA（需自備）后再進行檢測；

? 本產(chǎn)品的檢測范圍涵蓋所有支原體種類；

? 本產(chǎn)品不會檢測真核細胞和革蘭氏陰性菌的基因組DNA，與支原體親緣較近的革蘭氏陽性菌在使用本產(chǎn)品檢測時，檢測靈敏度也會降低10000倍，進而減少假陽性和提高特異性；

? 檢測結(jié)果異常時，建議復(fù)檢；

? 檢測結(jié)果為弱陽性時，建議繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)7天后，再進行復(fù)檢。