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一、引言

二、材料與方法

（一）人原代成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

1. 組織來(lái)源：獲取人體皮膚或其他含成纖維細(xì)胞豐富組織，在嚴(yán)格無(wú)菌條件下將組織剪成細(xì)小碎片，置于含抗生素（如青霉素 - 鏈霉素）的磷酸鹽緩沖液（PBS）中反復(fù)清洗，去除血液及雜質(zhì)。

2. 培養(yǎng)條件：將處理后的組織碎片接種于培養(yǎng)瓶中，加入含 10% - 15% 胎牛血清、1% 非必需氨基酸、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的高糖 DMEM 培養(yǎng)基，在 37°C、5% CO?飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代：待細(xì)胞融合度達(dá)到 70% - 80% 時(shí)，使用 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% 乙二胺四乙酸（EDTA）消化液進(jìn)行消化傳代，選取第 2 - 4 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（二）電穿孔轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1. 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒選擇與制備：挑選合適的報(bào)告基因質(zhì)粒（如增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 EGFP 質(zhì)粒），運(yùn)用商業(yè)化質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取與純化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度與純度，確保質(zhì)粒質(zhì)量符合轉(zhuǎn)染要求。

2. 電穿孔緩沖液篩選：對(duì)比多種常見(jiàn)電穿孔緩沖液（如 R 緩沖液、H 緩沖液等），通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察不同緩沖液對(duì)細(xì)胞狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率的初步影響，確定最適緩沖液用于正式實(shí)驗(yàn)。

3. 電穿孔參數(shù)設(shè)置：設(shè)置多組不同電壓（50V - 300V）、脈沖時(shí)長(zhǎng)（1ms - 50ms）、脈沖次數(shù)（1 - 5 次）以及不同的細(xì)胞密度（1×10? - 5×10? 個(gè) /ml）組合，每組設(shè)置至少 3 個(gè)重復(fù)樣本，以全面評(píng)估各參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效果的影響。

（三）電穿孔轉(zhuǎn)染操作流程

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人原代成纖維細(xì)胞，用預(yù)冷的選定電穿孔緩沖液重懸細(xì)胞，按照設(shè)定的細(xì)胞密度調(diào)整細(xì)胞懸液濃度。

2. 轉(zhuǎn)染體系構(gòu)建：將適量（0.5μg - 5μg）的 EGFP 質(zhì)粒與細(xì)胞懸液輕柔混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電穿孔 cuvette 中，避免產(chǎn)生氣泡，確保細(xì)胞與質(zhì)粒充分接觸。

3. 電穿孔操作：將裝有細(xì)胞 - 質(zhì)?；旌弦旱?cuvette 放入電穿孔儀中，依據(jù)設(shè)定的電壓、脈沖時(shí)長(zhǎng)和脈沖次數(shù)等參數(shù)進(jìn)行電穿孔處理。電穿孔結(jié)束后，立即將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的完整培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻后接種于培養(yǎng)板，放置于 37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（四）轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

1. 熒光顯微鏡觀察：在轉(zhuǎn)染后 24 - 48 小時(shí)，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的綠色熒光表達(dá)情況。隨機(jī)選取多個(gè)視野進(jìn)行拍照記錄，通過(guò)圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量的比例，以此作為轉(zhuǎn)染效率的直觀評(píng)估指標(biāo)。

2. 流式細(xì)胞術(shù)分析：收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用 PBS 清洗后重懸于適量的 PBS 中，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例，進(jìn)一步精確測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，并可同時(shí)分析細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分布等信息。

（五）細(xì)胞活力檢測(cè)

1. 臺(tái)盼藍(lán)拒染法：在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)（6 小時(shí)、24 小時(shí)、48 小時(shí)），取少量細(xì)胞懸液與 0.4% 臺(tái)盼藍(lán)溶液按 1:1 混合，在顯微鏡下觀察。未被染成藍(lán)色的細(xì)胞為活細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算活細(xì)胞比例，以評(píng)估細(xì)胞活力。

2. MTT 法：在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入 MTT 溶液（終濃度為 0.5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng) 4 小時(shí)后，小心吸去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解形成的紫色結(jié)晶物，使用酶標(biāo)儀在 570nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。吸光度值與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，通過(guò)與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，評(píng)估轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力變化。

三、結(jié)果

（一）不同電穿孔參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響

1. 電壓的作用：較低電壓（50V - 100V）時(shí)，轉(zhuǎn)染效率極低，隨著電壓升高，轉(zhuǎn)染效率逐漸上升，在 150V - 200V 區(qū)間內(nèi)上升趨勢(shì)明顯，當(dāng)電壓達(dá)到 250V 左右時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到峰值，但繼續(xù)升高電壓至 300V 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率略有下降，可能是由于過(guò)高電壓對(duì)細(xì)胞造成過(guò)度損傷，影響了質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的正常表達(dá)與維持。

2. 脈沖時(shí)長(zhǎng)影響：短脈沖時(shí)長(zhǎng)（1ms - 10ms）下轉(zhuǎn)染效率低下，隨著脈沖時(shí)長(zhǎng)增加到 20ms - 30ms，轉(zhuǎn)染效率顯著提高，而當(dāng)脈沖時(shí)長(zhǎng)超過(guò) 40ms 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率開始下降，同時(shí)細(xì)胞活力也受到較大影響，表明過(guò)長(zhǎng)的脈沖時(shí)長(zhǎng)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損害，不利于轉(zhuǎn)染過(guò)程的進(jìn)行。

3. 脈沖次數(shù)與細(xì)胞密度關(guān)聯(lián)：增加脈沖次數(shù)在一定程度上可提高轉(zhuǎn)染效率，脈沖次數(shù)從 1 次增加到 3 次時(shí)，轉(zhuǎn)染效率逐步上升，但當(dāng)脈沖次數(shù)達(dá)到 4 - 5 次時(shí)，細(xì)胞活力明顯下降，轉(zhuǎn)染效率的提升幅度也逐漸減小。細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有影響，較低細(xì)胞密度（1×10? - 1×10? 個(gè) /ml）時(shí)轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低，隨著細(xì)胞密度增加到 2×10? - 3×10? 個(gè) /ml，轉(zhuǎn)染效率逐漸升高，但過(guò)高細(xì)胞密度（超過(guò) 5×10? 個(gè) /ml）會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間相互作用復(fù)雜，轉(zhuǎn)染效率反而下降。

（二）不同電穿孔參數(shù)對(duì)細(xì)胞活力的影響

1. 高電壓（如 250V - 300V）和長(zhǎng)脈沖時(shí)長(zhǎng)（如 40ms - 50ms）均顯著降低細(xì)胞活力，表現(xiàn)為臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)的活細(xì)胞比例大幅減少，MTT 法測(cè)定的吸光度值急劇下降，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的皺縮、死亡等現(xiàn)象。

2. 過(guò)多的脈沖次數(shù)（如 4 - 5 次）以及過(guò)高的細(xì)胞密度（超過(guò) 5×10? 個(gè) /ml）也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后增殖能力減弱，形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)異常改變，如細(xì)胞變圓、脫落等。

（三）優(yōu)化電穿孔轉(zhuǎn)染條件的確立

四、討論