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一、引言

二、材料與方法

（一）奶牛乳腺上皮細胞的分離與培養(yǎng)

1. 組織采集：從健康奶牛的乳腺組織獲取樣本，在無菌條件下迅速將組織轉(zhuǎn)移至含預(yù)冷抗生素（如青霉素 - 鏈霉素混合液）的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，以防止微生物污染并維持組織活性。

2. 細胞分離：將乳腺組織仔細剪碎成細小塊狀，然后使用含有膠原酶等消化酶的消化液在特定溫度（如 37°C）和振蕩條件下進行消化處理，使乳腺上皮細胞從組織塊中解離出來。

3. 細胞培養(yǎng)：消化后的細胞懸液通過離心收集，用含 10% - 20% 胎牛血清、胰島素、表皮生長因子等營養(yǎng)成分的特定培養(yǎng)基（如 DMEM/F12 培養(yǎng)基）重懸細胞，接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，置于 37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基以維持細胞生長環(huán)境的穩(wěn)定。

（二）乳鐵素 H 基因構(gòu)建與載體選擇

1. 基因獲?。和ㄟ^基因克隆技術(shù)從含有乳鐵素 H 基因的模板（如特定細菌或乳腺組織 cDNA 文庫）中擴增出乳鐵素 H 基因片段，利用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)進行精確擴增，并對擴增產(chǎn)物進行純化與鑒定。

2. 載體構(gòu)建：將獲得的乳鐵素 H 基因片段與合適的真核表達載體（如 pcDNA3.1 載體）進行連接構(gòu)建重組質(zhì)粒。連接過程在連接酶的作用下進行，確保基因片段正確插入載體的多克隆位點，構(gòu)建完成后對重組質(zhì)粒進行酶切驗證和測序分析，以保證基因序列的準確性。

3. 載體轉(zhuǎn)染試劑選擇：篩選多種常用的轉(zhuǎn)染試劑（如 Lipofectamine 系列、聚乙烯亞胺（PEI）等），通過預(yù)實驗對比它們在奶牛乳腺上皮細胞中的轉(zhuǎn)染效率、細胞毒性等指標，確定最適轉(zhuǎn)染試劑用于后續(xù)正式實驗。

（三）細胞轉(zhuǎn)染實驗操作

1. 細胞準備：選取處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好且融合度在 60% - 80% 的奶牛乳腺上皮細胞，用無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細胞，去除殘留的血清成分，以減少血清對轉(zhuǎn)染效率的影響。

2. 轉(zhuǎn)染體系配制：按照選定轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將適量的重組乳鐵素 H 基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑在無血清培養(yǎng)基中輕柔混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，在室溫下孵育一定時間（如 15 - 30 分鐘），使質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合。

3. 轉(zhuǎn)染過程：將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到培養(yǎng)有奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)基中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布于細胞周圍，然后將細胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

（四）轉(zhuǎn)染效率檢測

1. 熒光報告基因檢測：若構(gòu)建的重組質(zhì)粒中攜帶熒光報告基因（如綠色熒光蛋白 GFP 基因），在轉(zhuǎn)染后 24 - 48 小時，使用熒光顯微鏡觀察細胞的熒光表達情況。隨機選取多個視野進行拍照記錄，通過圖像分析軟件統(tǒng)計發(fā)出熒光的細胞數(shù)量占總細胞數(shù)量的比例，作為轉(zhuǎn)染效率的初步評估指標。

2. 定量 PCR 檢測：提取轉(zhuǎn)染后細胞的總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，然后利用特異性引物對乳鐵素 H 基因進行定量 PCR 擴增，通過與內(nèi)參基因（如 β - 肌動蛋白基因）的擴增結(jié)果對比，計算出乳鐵素 H 基因在細胞中的相對表達量，從基因轉(zhuǎn)錄水平精確評估轉(zhuǎn)染效率。

（五）乳鐵素 H 表達與功能分析

1. Western blot 檢測：收集轉(zhuǎn)染后的奶牛乳腺上皮細胞，提取細胞總蛋白，采用 Western blot 技術(shù)檢測乳鐵素 H 蛋白的表達情況。通過與已知濃度的乳鐵素 H 標準品進行對比，確定轉(zhuǎn)染細胞中乳鐵素 H 蛋白的表達水平。

2. 抗菌活性檢測：將轉(zhuǎn)染后細胞的培養(yǎng)上清液收集，采用瓊脂擴散法或微量稀釋法檢測其對特定病原菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等）的抗菌活性。與未轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)上清液進行對比，評估乳鐵素 H 基因轉(zhuǎn)染對細胞分泌產(chǎn)物抗菌功能的影響。

3. 細胞免疫調(diào)節(jié)功能檢測：利用體外細胞共培養(yǎng)模型，將轉(zhuǎn)染后奶牛乳腺上皮細胞與免疫細胞（如巨噬細胞、淋巴細胞等）共培養(yǎng)，通過檢測免疫細胞的活化標志物（如細胞表面分子表達、細胞因子分泌等）變化，探究乳鐵素 H 基因轉(zhuǎn)染對乳腺上皮細胞免疫調(diào)節(jié)功能的作用。

三、結(jié)果

（一）奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)特性

1. 細胞形態(tài)：分離培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞呈現(xiàn)典型的上皮細胞形態(tài)，多為多邊形或鋪路石樣，細胞邊界清晰，細胞核明顯，在培養(yǎng)過程中細胞逐漸形成單層或多層的細胞群落，具有良好的生長增殖能力。

2. 生長曲線：通過定期計數(shù)細胞數(shù)量繪制生長曲線，結(jié)果顯示細胞在接種后的初期有短暫的潛伏期，隨后進入對數(shù)生長期，細胞數(shù)量快速增長，在達到一定密度后進入平臺期，生長速度逐漸減緩。

（二）乳鐵素 H 基因轉(zhuǎn)染效率

1. 熒光報告基因檢測結(jié)果：在轉(zhuǎn)染后 24 小時，熒光顯微鏡下可觀察到部分細胞發(fā)出綠色熒光，隨著時間推移到 48 小時，熒光細胞數(shù)量逐漸增多。經(jīng)統(tǒng)計分析，轉(zhuǎn)染效率在不同轉(zhuǎn)染條件下有所差異，在優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染效率可達到 [X]%（具體數(shù)值依實驗而定）。

2. 定量 PCR 檢測結(jié)果：定量 PCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后乳鐵素 H 基因的相對表達量較未轉(zhuǎn)染細胞顯著升高，表明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入奶牛乳腺上皮細胞并在轉(zhuǎn)錄水平上進行了有效表達。

（三）乳鐵素 H 表達與功能分析結(jié)果

1. Western blot 檢測：在轉(zhuǎn)染細胞的蛋白提取物中檢測到了與乳鐵素 H 分子量相符的特異性蛋白條帶，且條帶強度與轉(zhuǎn)染效率及基因表達量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，表明轉(zhuǎn)染細胞成功合成了乳鐵素 H 蛋白。

2. 抗菌活性檢測：轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出明顯的抗菌活性，抑菌圈直徑較未轉(zhuǎn)染細胞上清液顯著增大，表明乳鐵素 H 基因轉(zhuǎn)染增強了奶牛乳腺上皮細胞分泌產(chǎn)物的抗菌能力。

3. 細胞免疫調(diào)節(jié)功能檢測：在共培養(yǎng)體系中，轉(zhuǎn)染乳鐵素 H 基因的乳腺上皮細胞能夠促進巨噬細胞表面活化標志物的表達，同時誘導(dǎo)淋巴細胞分泌特定的免疫調(diào)節(jié)因子，如白細胞介素 - 6（IL - 6）和腫瘤壞死因子 - α（TNF - α）等，顯示出其對免疫細胞具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

（四）轉(zhuǎn)染對奶牛乳腺上皮細胞生理狀態(tài)的影響

1. 細胞活力：采用臺盼藍拒染法和 MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)，在合適的轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染后細胞活力在短期內(nèi)略有下降，但隨后能夠逐漸恢復(fù)并維持在相對穩(wěn)定的水平，表明轉(zhuǎn)染操作對細胞的生存能力未造成嚴重的長期損害。

2. 細胞凋亡：通過 Annexin V - FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染過程中僅有少量細胞發(fā)生早期凋亡，未出現(xiàn)大量細胞凋亡現(xiàn)象，進一步證明了優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件對細胞生理狀態(tài)的保護作用。

四、討論