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經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞表現(xiàn)出核形態(tài)的變化，包括DNA斷裂、染色質(zhì)縮合、核被膜降解、核出泡和DNA鏈斷裂。賽默飛提供各種TUNEL試劑盒和DNA染料用于分析這些變化；它們大多數(shù)與檢測(cè)細(xì)胞健康和活性參數(shù)的其他試劑和方案兼容。

賽默飛提供用于成像分析的染色質(zhì)縮合和TUNEL試劑盒，請(qǐng)?jiān)L問獲取產(chǎn)品最新信息。

什么是TUNEL試劑盒？

在程序性細(xì)胞死亡或凋亡的后期，DNA變得高度斷裂。這種斷裂提供了一個(gè)機(jī)會(huì)，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化的dUTP末端標(biāo)記(TUNEL)反應(yīng)，將修飾的dUTP連接到受損DNA的3 ' -OH端。然后，可以使用一系列不同的檢測(cè)策略來檢測(cè)修飾的dUTP，如BrdUTP或EdUTP。BrdUTP抗體已用于間接檢測(cè)，而通過偶聯(lián)生物素或熒光修飾的核苷酸（即生物素-dUTP或熒光素-dUTP）可實(shí)現(xiàn)直接檢測(cè)?！?/span>Click點(diǎn)擊化學(xué)"反應(yīng)是目前較新且能提高檢測(cè)靈活性的修飾方法。TUNEL檢測(cè)已成為廣泛使用的原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。

在本頁，您可以找到：

· 使用Click點(diǎn)擊化學(xué)鏈接的TUNEL試劑

· 用于組織分析的TUNEL試劑

· 分析培養(yǎng)細(xì)胞的TUNEL試劑

· DNA染料用于可視化染色質(zhì)縮合

· TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

使用點(diǎn)擊化學(xué)Click的TUNEL試劑盒

Click-iT TUNEL成像檢測(cè)試劑盒

傳統(tǒng)上，TUNEL試劑盒使用BrdUTP結(jié)合DNA，隨后通過各種方法進(jìn)行檢測(cè)。Thermo Fisher Scientific開發(fā)了經(jīng)改進(jìn)的TUNEL試劑盒，它使用TdT在斷裂DNA的3’-OH末端引入了炔烴修飾的dUTP、EdUTP（圖1）。在Invitrogen Click-iT TUNEL檢測(cè)中，使用Click點(diǎn)擊化學(xué)方法檢測(cè)這個(gè)合并的核苷酸，點(diǎn)擊化學(xué)是一種基于銅催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成的反應(yīng)，其高度特異性源于在生物分子、細(xì)胞、組織或模型生物中沒有類似的疊氮化物和炔烴反應(yīng)。可以通過熒光或比色的方法來檢測(cè)合并的EdUTP。

圖 1.在Click-iT TUNEL成像檢測(cè)試劑盒中提供了Click-iT EdUTP核苷酸結(jié)構(gòu)。

Click-iT TUNEL成像檢測(cè)試劑盒的基本步驟如圖2所示。處理樣品后，通過固定和滲透細(xì)胞或組織來保存晚期凋亡細(xì)胞，從而降低由于細(xì)胞分離和后續(xù)操作損失而導(dǎo)致的假陰性。然后通過TdT將EdUTP核苷酸快速合并到斷裂DNA中。下一步是偶聯(lián)染料或生物素疊氮化物，然后添加復(fù)染劑。與一步法摻入染料或生物素修飾的核苷酸相比，對(duì)于Click-iT TUNEL成像試劑盒，兩步法可在兩小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)的相同條件下檢測(cè)到更高比例的凋亡細(xì)胞（圖3）。

圖 2.用Click-iT TUNEL成像試劑盒檢測(cè)凋亡。

圖 3.比較不同修飾的dUTP檢測(cè)凋亡細(xì)胞的差異。用0.5μM星形孢菌素處理Hela細(xì)胞4小時(shí)。細(xì)胞固定和破膜后，根據(jù)Click-iT EdUTP、BrdUTP和另外2種不同熒光素dUTP產(chǎn)品的說明書進(jìn)行TUNEL成像檢測(cè)。根據(jù)陰性對(duì)照計(jì)算陽性百分比。使用Thermo Fisher Scientific公司的ArrayScan II進(jìn)行成像和分析。

Click-iT Plus TUNEL成像檢測(cè)試劑盒

最初的Click-iT TUNEL成像試劑盒依賴于銅的使用，并且我們發(fā)現(xiàn)生物分子對(duì)銅濃度表現(xiàn)出不同的敏感性。例如，用于催化鏈接化學(xué)反應(yīng)的高銅濃度會(huì)影響熒光蛋白(如GFP)與其他試劑兼容的能力，因?yàn)闊晒獾鞍椎臒晒鈺?huì)淬滅或使用肌動(dòng)蛋白特異性化合物鬼筆環(huán)肽時(shí)表現(xiàn)出結(jié)合能力下降。為了克服這些挑戰(zhàn)，我們開發(fā)了Click-iT Plus TUNEL試劑盒，經(jīng)優(yōu)化的銅濃度使熒光蛋白的信號(hào)更穩(wěn)定且提高與鬼筆環(huán)肽結(jié)合的兼容性，同時(shí)促進(jìn)檢測(cè)反應(yīng)。

用于組織分析的TUNEL試劑

用于熒光檢測(cè)的Click-iT Plus TUNEL試劑

原位凋亡檢測(cè)的Invitrogen Click-iT Plus TUNEL檢測(cè)試劑盒可適用于組織切片和粘附細(xì)胞。熒光檢測(cè)試劑盒與GFP或其他熒光蛋白兼容，并可與鬼筆環(huán)肽兼容，如圖4所示。Click-iT Plus TUNEL試劑盒具有明亮穩(wěn)定的熒光信號(hào)，可與Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 647疊氮化物一起使用。

圖 4.Click-iT Plus TUNEL試劑盒可以與多種其他熒光探針共同使用。用DNase I處理在腸肌中表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織，然后用Alexa Fluor 594染料進(jìn)行Click-iT Plus TUNEL檢測(cè)，再用Hoechst 33342染料和Alexa Fluor 647鬼筆環(huán)肽染色。（A）用Hoechst 33342染料（藍(lán)色）對(duì)細(xì)胞核染色，（B）在周圍肌肉層中檢測(cè)到GFP信號(hào)（綠色），（C）絲狀肌動(dòng)蛋白用Alexa Fluor 647鬼筆環(huán)肽（紫色）染色，以及（D）通過Click-iT Plus TUNEL試劑盒標(biāo)記Alexa Fluor 594染料（紅色）產(chǎn)生的就是TUNEL陽性信號(hào)。最后一個(gè)圖（E）是四個(gè)熒光信號(hào)疊加而成的圖像。

用于比色檢測(cè)的Click-iT TUNEL試劑盒

Invitrogen Click-iT TUNEL比色法IHC檢測(cè)試劑盒已經(jīng)過優(yōu)化，通過使用生物素疊氮化物和鏈霉親和素-過氧化物酶偶聯(lián)來識(shí)別組織中的凋亡細(xì)胞，盡管也可以用于粘附細(xì)胞。在將EdUTP摻入DNA片段位點(diǎn)后（圖5），用生物素疊氮化物標(biāo)記EdUTP。隨后添加鏈霉素親和素-過氧化物酶和DAB（過氧化物酶底物），會(huì)產(chǎn)生深棕色信號(hào)，可通過光學(xué)顯微鏡檢測(cè)并儲(chǔ)存數(shù)據(jù)。該檢測(cè)也可與其他比色組織染料共同使用（圖6）。

圖5.Click-iT TUNEL比色法IHC檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)工作流程。

圖6.用比色Click-iT TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒標(biāo)記小鼠組織切片。使用DAB標(biāo)記標(biāo)記福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）的8μm小鼠胸腺切片，使用Click-iT TUNEL比色法IHC檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞（暗褐色細(xì)胞核）。隨后用曙紅Y（粉紅色）對(duì)組織進(jìn)行染色，然后用甲基綠（藍(lán)色）進(jìn)行核復(fù)染、脫水，并硬固定在Thermo Scientific Cytoseal 60固定培養(yǎng)基中。使用EVOS FL自動(dòng)成像系統(tǒng)獲得明場(chǎng)圖像，20倍物鏡。

分析培養(yǎng)細(xì)胞的UNEL試劑盒

Invitrogen Click-iT TUNEL Alexa Fluor成像檢測(cè)試劑盒適用于HSC和成像分析培養(yǎng)的細(xì)胞。小量特異性標(biāo)記基使實(shí)驗(yàn)方案變得快速而有效。這個(gè)試劑盒用時(shí)在2小時(shí)內(nèi)，能高效鑒別細(xì)胞群凋亡的細(xì)胞。通過選擇熒光標(biāo)記，Click-iT TUNEL檢測(cè)試劑盒能與表面和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物檢測(cè)同時(shí)使用。然而，對(duì)于細(xì)胞骨架的檢測(cè)，我們建議您使用一抗來代替鬼筆環(huán)肽（圖7）。我們也不建議與熒光蛋白聯(lián)用。我們已經(jīng)把該試劑盒和各種凋亡誘導(dǎo)試劑（包括星形孢菌素）用HeLa、A549和CHO K1細(xì)胞中進(jìn)行了測(cè)試，同時(shí)通過抗體檢測(cè)凋亡標(biāo)志物（如裂解的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）、剪切的半胱天冬酶-3、磷酸化組氨酸2B）進(jìn)行了多重檢測(cè)。它也被證明可以有效地檢測(cè)人MCF-7乳腺癌細(xì)胞中siRNA敲低DEC2轉(zhuǎn)錄因子而引起的凋亡。

圖7.使用Click-iT TUNEL成像檢測(cè)試劑盒對(duì)晚期凋亡進(jìn)行檢測(cè)。用星形孢菌素處理HeLa細(xì)胞，然后固定并破膜。進(jìn)行Click-iT TUNEL Alexa Fluor 647成像檢測(cè)。用激活型caspase-3兔單克隆一抗檢測(cè)活化的半胱天冬酶-3，并用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG二抗(綠色)標(biāo)記。用小鼠單克隆抗微管蛋白抗體檢測(cè)微管蛋白，并用Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG（橙色）二抗標(biāo)記。細(xì)胞核用Hoechst 33342（藍(lán)色）染色。淺藍(lán)色代表半胱天冬酶（綠色）、Hoechst（藍(lán)色）和TUNEL（洋紅色）信號(hào)的疊加。

用于染色質(zhì)縮合可視化的DNA染料

DNA染料為區(qū)分凋亡細(xì)胞中的縮合提供了最快的途徑。細(xì)胞核染色適用于活細(xì)胞或固定細(xì)胞，我們提供廣泛的波長，更好的與其他標(biāo)記產(chǎn)品共同使用。ReadyProbes試劑在室溫下穩(wěn)定，并為方便即用滴管瓶形式的DNA染料。

Click-iT™ TUNEL細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)試劑盒

初代Click-iT™ TUNEL實(shí)驗(yàn)試劑盒針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)樣品優(yōu)化，也可用于組織樣品。我們建議對(duì)組織樣品使用Click-iT™ Plus TUNEL for In Situ Apoptosis Detection實(shí)驗(yàn)試劑盒；用于組織的Click-iT™ Plus TUNEL for In Situ Apoptosis Detection實(shí)驗(yàn)試劑盒的實(shí)驗(yàn)方案針對(duì)組織樣本優(yōu)化。通過改進(jìn)方案可以提高TdT酶進(jìn)入多層細(xì)胞組織樣品的效果。另外，相比于Click-iT™ Plus TUNEL試劑盒，我們發(fā)現(xiàn)初代Click-iT™ TUNEL試劑盒可能會(huì)在組織樣品出現(xiàn)高度非特異性結(jié)合和點(diǎn)狀染色。有一個(gè)增加組織透過性較好的方法是用蛋白酶K消化然后甲醛中再固定樣品以取代去污劑透化作用步驟。Click-iT™ Plus TUNEL試劑盒手冊(cè)第三部分的組織固定和透化作用方案可用于初代Click-iT™ TUNEL實(shí)驗(yàn)處理組織樣品。胃蛋白酶和其他的蛋白水解酶同時(shí)也可用于提高組織透過性。

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