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屢獲殊榮的 Invitrogen Attune CytPix 成像型流式細胞儀將聲波聚焦與高速明場相機相結(jié)合，能夠同時進行高通量的流式細胞分析和高分辨率的明場成像 。
使用 Attune 流式細胞儀軟件進行自動圖像分析 ，可將事件特征轉(zhuǎn)換為形態(tài)參數(shù)，并可與標(biāo)準(zhǔn)熒光和散射參數(shù)結(jié)合使用。
應(yīng)用文檔：自動圖像分析降低了流式細胞術(shù)設(shè)門策略的用戶間差異
Attune CytPix 成像型流式細胞儀榮獲醫(yī)療技術(shù)類 2003 年愛迪生獎™ 。Edison Awards 是廣受贊譽的獎項，旨在表彰在新產(chǎn)品和服務(wù)開發(fā)、設(shè)計和創(chuàng)新方面的出色表現(xiàn)。
從流式細胞樣本中獲得更多數(shù)據(jù)而不影響速度。使用 Attune CytPix 將高參數(shù)流式細胞分析與自動化圖像分析相結(jié)合，以了解有關(guān)樣本的更多信息。
在 Attune CytPix 流式細胞儀上采集樣本時，高速明場相機可采集并儲存檢測到的事件圖像，每秒可多達6000張，具體取決于流速和圖像大小。為實現(xiàn)更高靈活性，可使用 Attune 流式細胞儀軟件按需調(diào)整圖像采集頻率，并根據(jù)需要選擇特定的設(shè)門以進行圖像采集。聲波聚焦有助于定位細胞，從而獲得清晰的細胞圖像。
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聲波聚焦使得細胞處于良好成像位置
沒有采用聲波聚焦技術(shù)（左）時，微球沒有聚集在中心位置且經(jīng)常模糊不清。聲波聚焦（右）可減少橫向位置變異、時間變異和景深限制，從而可獲得清晰的圖像。
聲波聚焦和高速相機相結(jié)合后，不論進樣速度快還是慢，都可以得到 CAR-T 細胞的穩(wěn)定成像。根據(jù)實驗需求輕松調(diào)節(jié)焦距和相機設(shè)置。
Attune 流式細胞儀軟件 使用經(jīng)過白細胞和微球預(yù)培訓(xùn)的模型，通過自動圖像分析功能得出形態(tài)參數(shù)。該軟件能夠以每秒高達1,000幅圖像的速率進行圖像分析，并且可由用戶在軟件后臺運行的進程隊列中進行管理。這些基于圖像的擴展參數(shù)提供了數(shù)據(jù)，使用戶能夠通過細胞計數(shù)（顆粒計數(shù)）和形態(tài)學(xué)特征（如圓形度 [圓度]、大小 [面積]、形狀 [偏心率] 和復(fù)雜性 [熵]）來確認單體。 對這些擴展參數(shù)設(shè)門后，您可以快速、準(zhǔn)確地鑒別感興趣的細胞群，從而在不需要手動審查或僅需少量手動審查的情況下確認設(shè)門策略。
單個事件的圖像和衍生的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)可以幫助大量幾乎無限的流式細胞術(shù)應(yīng)用。功能范圍包括：
優(yōu)化和確認門控策略
利用圖像衍生的數(shù)據(jù)設(shè)門以排除雙聯(lián)體和碎片，并用圖像確認圈門的準(zhǔn)確性。
更深入地表征細胞群
在現(xiàn)有流式方案中對不同形態(tài)的細胞群體進行記錄和表征。
分析細胞間相互作用
可視化并區(qū)分偶合事件與細胞間相互作用。
可視化大量細胞群的結(jié)構(gòu)特征
使用高通量、詳細的圖像驗證
測量衍生的圖像參數(shù)
使用 Attune 流式細胞儀軟件6.0的圖像分析功能
高通量質(zhì)量控質(zhì)
通過向細胞培養(yǎng) QC 工作流程中加入快速成像結(jié)果，從而快速檢測質(zhì)量問題
優(yōu)化設(shè)門策略。即使是穩(wěn)健的手動單體設(shè)門也容易出錯，因此它仍是幾乎所有流式細胞分析測定的主觀決策點。成像結(jié)果有助于確認和調(diào)整設(shè)門，以便只圈出單個目的細胞。
在此，一名有經(jīng)驗的用戶已自信地為單體設(shè)門。 在評估手動單體門后，源自 CytPix 圖像的參數(shù) ParticleCount 顯示此門包含超過 4% 的聚合體。
也許更重要的是，這些事件含有表型明顯不同的細胞， 這可導(dǎo)致對雙陽性事件（特別是在稀有細胞群中）做出錯誤結(jié)論。
使用氯化銨裂解緩沖液裂解的老化人類全血 (AllCells)。圖像處理是使用 Cells Model_Speed Optimized 模型完成的。顯示的統(tǒng)計數(shù)據(jù)為門內(nèi)細胞百分比。
將流式結(jié)果與高速、高分辨率成像相結(jié)合，從而增加了設(shè)門和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性
細胞培養(yǎng)質(zhì)控。在質(zhì)量控制（QC）工作流程中增加快速成像可在早期階段發(fā)現(xiàn)和追蹤細胞培養(yǎng)相關(guān)問題。例如，在某實驗室中，在對 Ramos（淋巴瘤）細胞培養(yǎng)進行常規(guī)傳代檢查時觀察到，盡管看起來是在融合，但細胞計數(shù)和存活率減少。進一步檢測發(fā)現(xiàn)存在大量微生物污染，但這是從何時何處開始的？
由于該細胞系之前已經(jīng)在Attune CytPix 成像型流式細胞儀上進行了分析，研究人員重新打開圖像，發(fā)現(xiàn)至少五天前就記錄了微生物感染。當(dāng)時，污染早期的跡象被誤認為碎片，但回顧性研究證實培養(yǎng)物中存在具有相同特征的問題細胞。追蹤感染幫助實驗室建立了額外的實驗室規(guī)程，以篩選和保護對實驗具有關(guān)鍵性作用的細胞系。
在一次常規(guī)傳代檢查時，培養(yǎng)物中的 Ramos（淋巴瘤）細胞顯示細胞計數(shù)和存活率減少，盡管看起來是在融合。進一步調(diào)查顯示有微生物污染，且通過 Attune CytPix 流式細胞儀的成像和反向設(shè)門得到證實。這種污染的早期跡象最初被誤認為是碎片。
查看 Attune CytPix 成像型流式細胞儀更多樣本數(shù)據(jù)
表征細胞群。圖像中的形態(tài)學(xué)信息增加了流式細胞數(shù)據(jù)的豐度。 例如，圖中顯示了使用 Annexin V 和 PI 的常規(guī)細胞凋亡測定，添加了細胞成像以表征每個細胞群中的細胞，從而顯示不同形態(tài)特征。如果僅通過流式染色分析無法獲取該形態(tài)變化的信息。
用 10 µM XSJ 37oC 培養(yǎng) Jurkat 細胞 4 小時，以誘導(dǎo)細胞凋亡。樣本用 Annexin V 染色和 PI 染色后，在 Attune CytPix 成像型流式細胞儀上以 100 µL/分鐘的流速進行數(shù)據(jù)采集。從單個細胞群中，設(shè)門策略鑒別出三個細胞亞群。約 50% 的凋亡活細胞（Annexin V+PI–，右下）出現(xiàn)某種形式的凋亡小體，如氣泡。約 25% 的死的凋亡細胞（Annexin V+PI+，右上）的細胞表面顆粒度增大，且不完整細胞更多。約 10% 的健康細胞（Annexin V–，左下）有凋亡小體（盡管沒有 Annexin V? 細胞的那樣嚴重）。
"一張圖片雖然抵不上 1000 個點，但確實通過觀察圖像有助于進行數(shù)據(jù)分析。很高興能夠看與染色相關(guān)的圖像。例如，AnnexinV 陽性細胞的形態(tài)與健康細胞不同，或者 CD14+ 單核細胞比 CD3+/CD4+/CD14- 淋巴細胞體積更大、內(nèi)容物更多。此外，它還可通過圖像查看單細胞門內(nèi)含有多少黏連細胞，并非常適合在分析中驗證異常雙陽性細胞的狀態(tài)。"
威斯康星大學(xué)麥迪遜醫(yī)學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院
分析細胞間相互作用。圖像甚至能顯示出細胞間的相互作用。 圖中，經(jīng)過基因改造的 CAR T 免疫細胞與 Ramos（淋巴瘤）細胞共同培養(yǎng)后進行染色，在 Attune CytPix 成像型流式細胞儀上進行采集和成像分析。第二象限的圖像（兩種染料均為陽性，作為單個事件采集）顯示 CAR T 細胞對靶向 Ramos 細胞具有明顯的殺傷作用，提供了改造后細胞具有功能的確切證據(jù)。
分別使用 CellTrace Far Red 和 Violet 標(biāo)記 CAR-T 和 Ramos 細胞并以 1:1 比例在 37°C 下孵育 1 小時。 在 Attune CytPix 成像型流式細胞儀上以 200 μL/分鐘、 >8 x 105 個細胞/mL 的設(shè)置采集未過濾樣本的圖像。第一象限（中上）、第四象限（右下）和第三象限（左下）的圖像分別顯示單個 Ramos 細胞、CAR-T 細胞和碎片。第二象限的圖像（對兩種染料均呈陽性，右上）顯示融合在一起的兩種細胞類型，這是作為單個事件采集的，因為 CAR-T 細胞吞噬了 Ramos 細胞。
我們之前展示了拍攝 CAR-T/Ramos 細胞相互作用圖像的能力?，F(xiàn)在我們來看看最感興趣的細胞群—雙陽性事件，以了解更多信息?，F(xiàn)在我們可以使用源自圖像的擴展參數(shù)（圓度與強度偏斜度）來進一步檢查這些細胞群的特征并改進這些事件的設(shè)門，從而提高數(shù)據(jù)穩(wěn)健性。在此，通過使用 基于圖像的定量參數(shù)的設(shè)門策略，我們可區(qū)分相互作用細胞與偶合事件，從而更準(zhǔn)確地分析相互作用細胞。
分別使用 CellTrace Far Red 和 Violet 標(biāo)記 CAR-T 和 Ramos 細胞并以 1:1 比例在 37°C 下孵育1小時。在 Attune CytPix 成像型流式細胞儀上以 200 μL/分鐘、>8 x 105個細胞/mL 的設(shè)置采集未過濾樣本的圖像。第一象限（左上）、第三象限（右下）和第四象限（左下）的圖像分別顯示單個 Ramos 細胞、CAR-T 細胞和碎片。第二象限的圖像（對兩種染料均呈陽性，右上）顯示融合在一起的兩種細胞類型，這是作為單個事件采集的，因為 CAR-T 細胞吞噬了 Ramos 細胞。百分比為設(shè)門 %。
在細胞圖庫中，帶注釋的事件具有黑色輪廓，且?guī)в兄甘揪又卸ㄎ坏狞S點。圖像處理是使用 Cells_Half_Resolution_v22 模型完成的。利用圓度與強度偏斜度，使我們能夠區(qū)分黏連細胞相互作用（CAR-T 細胞與 Ramos 細胞間）與分離的細胞（即細胞處于同一視野中但未顯示出細胞相互作用）。
利用Attune CytPix 成像型流式細胞儀對細胞進行反向設(shè)門，基于圖像形態(tài)可能發(fā)現(xiàn)更多感興趣的細胞亞群，而傳統(tǒng)流式數(shù)據(jù)無法提供這些信息。
例如，大腸桿菌細胞可培養(yǎng)為兩種菌落形成單位 (CFU)： 類似于單細胞的短 CFU，以及帶不裂變環(huán)的加長結(jié)構(gòu)，代表在每個近似細胞長度處不縊縮。傳統(tǒng)單個細胞門（SSC-A/SSC-H）和熒光信號門（SSC/核染色）均無法區(qū)分這些細胞群。但通過 Attune CytPix 成像型流式細胞儀，可以查看和分類圖像信息，并根據(jù)其形態(tài)特征為不同 CFU 類型進行設(shè)門。
兩種大腸桿菌 CFU 類型的區(qū)分。大腸桿菌在 37oC 條件下培養(yǎng)過夜，然后在 4oC 條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天。使用 Attune CytPix 流式細胞儀以 100 μL/分鐘的流速進行樣本數(shù)據(jù)采集?？梢詮倪@些圖像鑒別兩類 CFU：(A) 代表單細胞的短菌落和 (B) 帶不裂變環(huán)的加長結(jié)構(gòu)。各亞群細菌的典型圖像如圖所示。對所選圖像反向設(shè)門顯示兩個亞群在 FSC/SSC 點圖上不同（橙色點，左）。
無需分割樣品或修改您的流式細胞術(shù)實驗方案。簡化您的成像和流式細胞分析工作流程，節(jié)省時間。
Attune CytPix 成像型流式細胞儀的自動化圖像分析功能簡介。
Attune CytPix 成像型流式細胞儀自動化圖像分析功能可在一個步驟中提供兩個數(shù)據(jù)集。
一組專家討論了在 Attune CytPix 流式細胞儀支持下進行流式細胞術(shù)實驗中成像數(shù)據(jù)的益處
觀看 Cora Chadick 博士展示 Invitrogen Attune CytPix 流式細胞儀
科學(xué)家 Greg Kaduchak 討論了利用 Attune CytPix 流式細胞儀的高分辨率明場成像來克服流式細胞術(shù)的難題。
如何在 Attune CytPix 流式細胞儀上設(shè)置和采集流式細胞術(shù)和成像數(shù)據(jù)
Introduction video of the features and benefits of the Attune CytPix Flow Cytometer
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